详情

原文传递一种检测衰老细胞用的抗体、试剂盒及检测方法

专利名称：	一种检测衰老细胞用的抗体、试剂盒及检测方法
摘要：	本发明涉及细胞检测技术领域，一种检测衰老细胞用的抗体，所述抗体为以下中的至少一种：p16INK4a，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，p53，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，p21，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，pRB，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，p19ARF，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，p38MAPK，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，p14ARF，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，p15INK4b，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，p62，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，p65，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州晟康细胞生物科技有限公司
发明人：	王书刚
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910147586.7
公开号：	CN110161226A
代理机构：	杭州九洲专利事务所有限公司
代理人：	姚旺波
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311121 浙江省杭州市余杭区仓前街道欧美金融城1幢1622室
主权项：	1.一种检测衰老细胞用的抗体，其特征在于，所述抗体为以下中的至少一种： p16INK4a，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， p53，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示， p21，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示， pRB，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示， p19ARF，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示， p38MAPK，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示， p14ARF，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示， p15INK4b，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示， p62，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示， p65，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。 2.一种基于权利要求1所述抗体的检测衰老细胞用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含荧光活力染料、针对衰老细胞靶标或磁珠靶标的荧光标记的抗体，该抗体包含有p16INK4a、p53、p21、pRB、p19ARF、p38MAPK、p14ARF、p15INK4b、p62、p65抗体中的至少一种。 3.一种如权利要求2所述检测衰老细胞用的试剂盒的制备方法，其特征在于：分别制备磁珠和抗体样品，去除未反应组件后进行抗体偶联。 4.如权利要求3所述的检测衰老细胞用的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备磁珠按以下步骤进行：取出65～85μl空白的磁珠用去离子水洗涤两次，将磁珠涡旋并超声处理以避免聚集并确保溶液中的珠粒均匀分布；之后悬浮于80μL含有100mM磷酸钠，10μL N-羟基硫代琥珀酰亚胺和10μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的活化缓冲液中，稀释至50mg/mL的浓度备用；用去离子水配置1M DTT；取2μl 1M DTT加入到含有磁珠的Ep管中并再次涡旋混匀；混合后，将磁珠在室温下避光保温20分钟；用PBS缓冲液洗涤三次，在室温下在轨道振荡器上孵育2小时后，用悬浮在1mL的洗涤/储存缓冲液中，在2℃至8℃下避光保存。 5.如权利要求4所述的检测衰老细胞用的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备抗体样品按以下步骤进行：将磁珠通过旋转保持悬浮，加入100μL的缀合物溶液，在蛋白质浓度最大情况下，每个磁珠可结合约5×106个被测蛋白分子；将混合物在轨道振荡器上在室温下在黑暗中温育1小时。 6.如权利要求5所述的检测衰老细胞用的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述去除未反应组件按以下步骤进行：用BCB缓冲液洗涤磁珠三次以除去非特异性结合的靶标，将磁珠重悬于2mL含有磷酸钠，Sulfo-NHS和EDC的活化缓冲液中并通过涡旋分散磁珠。 7.如权利要求6所述的检测衰老细胞用的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述抗体偶联按以下步骤进行：将缓冲液中的活化蛋白质转移到含有先前制备的功能性磁珠的Ep管中并涡旋混匀，并在振荡器上室温避光孵育1小时；将2μl含有磷酸钠，Sulfo-NHS和EDC的活化缓冲液加入到含有功能性磁珠和活化蛋白的Ep管中，涡旋混匀并在振荡器上孵育15分钟；温育后，将1ml储存缓冲液加入管中，离心；用储存缓冲液洗涤重复三次；然后，将重悬于0.5ml储存缓冲液中的磁珠颗粒在4℃下储存，浓度为6×106磁珠/ml。 8.一种基于权利要求2所述试剂盒的衰老细胞检测方法，其特征在于：使用试剂盒对衰老细胞的衰老标志物进行标记，再应用流式细胞统计衰老标志物。
所属类别：	发明专利