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原文传递区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒

专利名称：	区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒
摘要：	区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒，属于病毒检测领域。本发明以NP蛋白为免疫抗原，以单克隆抗体为抗体诊断试剂，利用棋盘法对包被抗原及单抗浓度进行优化，对包被时间、一抗浓度及孵育时间、二抗浓度及孵育时间等条件优化；根据工作浓度将免疫抗原包被于ELISA孔中，同时以不同稀释倍数的样本血清与固定稀释倍数的单克隆抗体混合后进行阻断实验，将混合物与固相抗原结合作用，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG为二抗继续孵育，用TMB显色液显色，加入2M硫酸溶液终止反应。本发明可有效移除传染源，消灭持久疫源地的存在，为新城疫的净化提供理论依据，具有检测灵敏、准确，操作简便及特异性强的优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	吉林大学
发明人：	丁壮;林洪哲;李金斗;丁佳欣;徐小洪;钱晶;尹仁福;丁伟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910449511.4
公开号：	CN110161246A
代理机构：	长春众邦菁华知识产权代理有限公司
代理人：	于晓庆
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	130000 吉林省长春市朝阳区前进大街2699号
主权项：	1.区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备免疫抗原 (1)将NP蛋白基因克隆至T载体中，构建重组克隆质粒T+NP，并测序鉴定； (2)对重组克隆质粒T+NP和pET28a(+)载体进行双酶切，将回收的目的基因及载体基因进行连接构建重组表达质粒pET28a+NP； (3)对重组表达质粒pET28a+NP进行诱导表达，经纯化后获得NP蛋白，作为免疫抗原；步骤二、制备单克隆抗体 (1)将纯化的NP蛋白免疫BALB/c小鼠，再将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合筛选，制备杂交瘤细胞株； (2)将杂交瘤细胞株腹腔注射BALB/c小鼠，取腹水加以纯化，即为单克隆抗体，作为抗体诊断试剂；步骤三、间接竞争ELISA方法条件优化抗原包被浓度为0.781μg/mL，单克隆抗体稀释倍数为1:800，单克隆抗体孵育时间为90min，酶标二抗稀释倍数为1:5000，酶标二抗孵育时间为60min，样品血清稀释倍数为1:20；步骤四、确定间接竞争ELISA方法的判定标准当待检血清抑制率I％≥35％时，判定为阳性即野毒感染；当待检血清抑制率I％<35％时，判定为阴性即新城疫病毒样颗粒疫苗免疫；步骤五、待检血清检测根据步骤三确定的优化条件，将免疫抗原包被于ELISA孔中，将稀释后的样品血清与单克隆抗体混合后进行阻断实验，再与固相抗原结合作用，加入酶标二抗继续孵育，最后用TMB显色液显色，加入2M硫酸溶液终止反应并读数。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一(1)中，所述NP蛋白基因的构建过程如下：以新城疫病毒流行优势强病毒株NA-1为模板，采用PCR扩增NP基因，引物序列如下： NP-NheI-F：5’-CGGCTAGCATGTCGTCTGTCTTTGACGAA-3’， NP-NotI-R：5’-ATTTGCGGCCGCGATCAGTATCCCCAATCAGTGTC-3’； PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10分钟；PCR扩增产物经1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测分析，进行胶回收纯化。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一(2)中，连接体系为：目的片段4μL、载体基因1μL、T4 DNA连接酶1μL、Buffer 4μL。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一(2)中，双酶切采用Nhe I和Not I。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶标二抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五的具体检测过程如下： i包被：将纯化的NP蛋白稀释至0.781μg/mL，包被于96孔ELISA板上，包被量为100μL/孔，4℃过夜； ii洗板：弃掉上清并拍干，加入250μL的1％PBST洗板，清洗3次，每次5min； iii封闭：加入100μL的1％脱脂奶粉，置于37℃封闭60min，洗板同步骤ii； iv竞争：将待检血清与单克隆抗体混合均匀，混合体积为100μL，待检血清稀释倍数为1:20，单克隆抗体稀释倍数为1:800，加入反应孔中，加入量为100μL/孔，置于37℃反应90min，洗板同步骤ii； v加入酶标二抗：每孔加入100μL酶标二抗，酶标二抗的稀释倍数为1:5000，于37℃反应60min，洗板同步骤ii； vi显色及终止：每孔加入100μL可溶型单组分TMB底物溶液，显色10min，每孔加入50μL的2M硫酸终止反应； vii读数：显色前预热酶标仪，OD450读取数值。 7.区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的试剂盒，其特征在于，包括：NP蛋白、单克隆抗体、酶标二抗、可溶型单组分TMB底物溶液、硫酸。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述NP蛋白的浓度为0.781μg/mL，所述单克隆抗体的稀释倍数为1:800，所述单克隆抗体的孵育时间为90min，所述酶标二抗的稀释倍数为1:5000，所述酶标二抗的孵育时间为60min。 9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述NP蛋白的制备方法如下： (1)将NP蛋白基因克隆至T载体中，构建重组克隆质粒T+NP，并测序鉴定； (2)对重组克隆质粒T+NP和pET28a(+)载体进行双酶切，将回收的目的基因及载体基因进行连接构建重组表达质粒pET28a+NP； (3)对重组表达质粒pET28a+NP进行诱导表达，经纯化后获得NP蛋白，作为免疫抗原。 10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述NP蛋白基因的构建过程如下：以新城疫病毒流行优势强病毒株NA-1为模板，采用PCR扩增NP基因，引物序列如下： NP-NheI-F：5’-CGGCTAGCATGTCGTCTGTCTTTGACGAA-3’， NP-NotI-R：5’-ATTTGCGGCCGCGATCAGTATCCCCAATCAGTGTC-3’； PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30秒、65℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10分钟；PCR扩增产物经1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测分析，进行胶回收纯化。
所属类别：	发明专利