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原文传递一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒及其制备方法

专利名称：	一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒及其制备方法
摘要：	本发明涉及一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒及其制备方法，属于试剂盒制备技术领域，试剂盒包括：（1）固相凝集反应微板；（2）低离子强度溶液；（3）指示系统；（4）阴性对照血清；（5）阳性对照血清；制备方法包括：（1）固相凝集反应微板的制备；（2）低离子强度溶液的制备；（3）指示系统的制备；（4）阴性对照血清制备；（5）阳性对照血清制备；通过创新性的利用单克隆抗体对红细胞的高特异性吸附、利用冷冻干燥保存技术、利用高灵敏度的二步法指示系统，切实解决目前新生儿溶血病检测方法中灵敏度低、红细胞难保存、易漏检抗体等难题，为临床一线检测工作提供一种高性价比的新生儿溶血病实验检测试剂盒。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	骆宏
发明人：	骆宏;罗广平
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910302941.3
公开号：	CN110174520A
代理机构：	广州市南锋专利事务所有限公司
代理人：	刘媖
分类号：	G01N33/80(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510095 广东省广州市越秀区麓苑路31号广州血液中心输血研究所
主权项：	1.一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：该新生儿溶血病实验检测试剂盒，包括： (1)固相凝集反应微板，所述的固相凝集反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条组成，微板条的U型孔底内表面包被有高特异性的抗红细胞单克隆抗体，已筛选的合格A、B、O型红细胞通过单克隆抗体对红细胞的高特异性免疫反应，被均匀地包被在孔底内表面，经裂解后形成固定于U型孔底内表面的红细胞膜，在此基础上加入细胞膜冷冻保护液，经过冷冻干燥后制备的微板； (2)低离子强度溶液，所述的低离子强度溶液包含甘氨酸和0.1％叠氮化钠； (3)指示系统，所述的指示系统包括指示红细胞和抗人球蛋白试剂； (4)阴性对照血清，是未含有不规则抗体且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清； (5)阳性对照血清，是包含有IgG抗-D且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清。 2.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，所述的微板条U型孔底内表面已经包被抗红细胞单克隆抗体，其对A、B、O型红细胞的吸附作用具有高度特异性。 3.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述的红细胞膜是将包被于96孔U型底微板条的A、B、O型红细胞裂解后所得，其血型系统抗原包括：ABO血型抗原、Rh血型抗原、Kidd血型抗原、MNSs血型抗原、Duffy血型抗原、Luthran血型抗原、Lewis血型抗原、P血型抗原，用于包被的A、B、O型红细胞涵盖下列抗原：D、C、E、c、e、JKa、JKb、M、N、S、s、Fya、Fyb、Lub、P1、Mur抗原。 4.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述的细胞膜冷冻保护液为8％的蔗糖溶液。 5.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述指示系统中的指示红细胞是指IgG抗-D致敏的O型RhD(+)红细胞悬液，浓度为0.2～0.6％。 6.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述指示系统中的抗人球蛋白试剂是指1:1～1:128倍稀释的羊抗人或者兔抗人IgG抗体。 7.一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： (1)固相凝集反应微板的制备； (2)低离子强度溶液的制备； (3)指示系统的制备； (4)阴性对照血清的制备； (5)阳性对照血清的制备；具体步骤如下： (1)筛选铺板用A、B、O型红细胞采用单克隆抗-A、抗-B、抗-D筛选出符合国家血液质量标准的A RhD(+)、B RhD(+)红细胞各3人份，各型别的3人份等量混合后洗涤6次，备用；ORhD(+)红细胞进行初筛后，要根据抗原互补原则进一步筛选特殊抗原，具体抗原谱见表1；筛选成功后，将3人份的O细胞等量混合洗涤6次，与前述筛选出A、B型红细胞共同组成铺板用红细胞；表1 铺板用O型红细胞抗原谱 (2)固相凝集反应微板的制备空白微板材质为聚苯乙烯，作用是包被抗红细胞单克隆抗体、固定A、B、O型红细胞膜、容纳受检血浆、低离子液和指示系统，本身不参与化学反应，微板的条与条可拆卸；抗红细胞单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释后，每孔中加入100μL，室温包被16小时，在此基础上，将上述(1)中的A、B、O型红细胞制备为0.1％浓度的悬液，每个微孔中加入100μL，离心5分钟后，洗涤5次，加入红细胞裂解液进行裂解；洗涤板条后，加入含8％蔗糖的冷冻保护液，50μL/孔，然后去掉孔中液体，并用吸水纸吸干残液，放入冷冻干燥机中冻干2小时，取出后装入铝箔袋中，加热密封即可； (3)低离子强度溶液的制备称取18克甘氨酸和1克叠氮钠用纯化水溶解后，定容至1L，再加入适量的溴甲酚紫溶液，直至溶液颜色由透明无色变为深紫色，调节溶液pH至6.8； (4)指示系统的制备指示系统包括指示红细胞和兔或羊抗人球蛋白试剂，指示红细胞的制备过程如下：洗涤后制成压积的O型红细胞，加入等体积的IgG抗-D，37℃孵育50分钟，制得IgG抗-D致敏的红细胞，生理盐水洗涤5次后，用红细胞保存液保存，抗人球蛋白试剂的制备过程如下：将兔或羊抗人球蛋白试剂用抗体稀释液进行稀释，与致敏红细胞反应，以离心后显微镜下观察至不凝集管作为抗人球蛋白试剂的稀释倍数，该稀释倍数的抗人球试剂与已致敏的O型红细胞悬液构成本发明的指示系统； (5)阴性对照血清的制备：筛选出与本发明所述的抗筛细胞均无凝集反应的人血清，加入叠氮化钠，终浓度为为0.10％； (6)阳性对照血清制备：是指包含有IgG抗-D且加入0.10％叠氮化钠的人血清。 8.根据权利要求7所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的微板的材质为聚苯乙烯。 9.根据权利要求7所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的微板的条与条可拆卸。
所属类别：	发明专利