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原文传递一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法

专利名称：	一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法
摘要：	本发明公开了一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，包括如下内容：先采集组织表面的脂质分子并保持其原位信息；再借助于激光解吸/电离质谱平台，在无基质参与的情况下获取组织表面的脂质分子特征指纹谱图；再基于组织表面的脂质特征指纹谱图，结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定；最后结合质谱成像技术实现无切片情况下的组织分子数字成像，用于判别肿瘤边界；本发明实现快速、高效、高准确率的临床组织鉴定、肿瘤亚型判别和肿瘤边界成像，提高检测通量，增加组织表面的脂质分子信息的稳定性和在肿瘤组织鉴别中的差异性维度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	邬建敏;陈晓明
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910577241.5
公开号：	CN110243921A
代理机构：	杭州裕阳联合专利代理有限公司
代理人：	金方玮
分类号：	G01N27/62(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	310000 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
主权项：	1.一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，用取样芯片从组织表面进行脂质取样；步骤二，借助于激光解吸/电离质谱平台，在无基质参与情况下获取组织表面的脂质分子特征指纹谱图；步骤三，基于组织表面的脂质特征指纹谱图，结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定；步骤四，结合质谱成像技术实现在无切片的情况下进行组织分子数字成像，用于判别肿瘤边界。 2.根据权利要求1所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，用取样芯片从组织表面进行脂质取样；步骤二，将样本送入MALDI-MS仪器，选择激光能量、检测模式和分子量检测范围，在对检测范围内进行标准品分子量校正后，依次采集多个样本在多个硅纳米线芯片上的脂质指纹谱图或结合成像模式对同片芯片上的各个位点进行二维扫描；所述检测模式包括：负离子模式和正离子模式；对于需要进行结构鉴定的分子在同台仪器中选定分子量，设定合适的质谱能量分别获取母离子和子离子信号，并叠加，结合脂质数据库比对二级谱图结果对脂质分子进行鉴定；步骤三，基于组织表面的脂质特征指纹谱图，结合统计分析方法建立多种肿瘤的判别模型，对肿瘤组织与正常组织、各种肿瘤组织的亚型进行判定；具体过程为：将获取的原始脂质指纹谱图的ASCII数据导出，通过数学软件设定分子信息提取程序，获取原始谱图在设定分子量范围内的所有峰的质荷比和归一化后的相对强度信息；步骤四，将步骤三得到的相对强度信息经单变量统计分析和多变量统计分析方法筛选特征峰或特征比值，并用于分析同种癌症的癌组织与非癌组织、各种亚型癌组织、各种来源的癌组织之间的显著性差异水平；将每个病人的原始数据、归一化后的数据以及特征分子集统一归类储存，联合其组织的病理检查结果、患者的临床特征及愈后跟踪信息建立大样本数据库；步骤五，以步骤四得到的大样本数据库为基础构建判别与预测模型，判别与预测模型先以已有数据进行训练与交叉验证，再以部分样本为测试集测试其判别和预测能力；判别和预测能力通过计算敏感性、特异性、准确率以及AUC值进行评估；步骤六，以构建的数据模型为基础创建能够实现数据输入、处理和结果导出的人机界面，将步骤三至五的信息集合在该界面中，实现已有样本数据库的数据调动和未知样本的归属和判别。 3.根据权利要求2所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，将获取的原始脂质指纹谱图的ASCII数据导出，通过数学软件设定分子信息提取程序，获取原始谱图在设定分子量范围内的所有峰的质荷比和归一化后的相对强度信息；所述分子信息包括：所有检测到的峰信息，经过单变量分析之后满足显著性差异要求的特征信息；所述单变量分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；所述归一化方法包括：全谱范围内的峰强度归一化，按照脂质分子类别进行分段归一化，提取双峰构成的分子对的比值数据。 4.根据权利要求2所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，将得到的相对强度信息经单变量统计分析和多变量统计分析方法筛选特征峰或特征比值，并用于分析同种癌症的癌组织与非癌组织、各种亚型癌组织、各种来源的癌组织之间的显著性差异水平；将每个病人的原始数据、归一化后的数据以及特征分子集统一归类储存，联合其组织的病理检查结果、患者的临床特征及愈后跟踪信息建立大样本数据库；所述单变量统计分析包括：t检验，方差分析，Mann-Whitney U检验；所述多变量统计分析包括：PCA主成分分析，HCL分层聚类分析，SOM自组织映射，LDA线性判别分析，PLS-DA偏最小二乘法-判别分析，OPLS-DA正交偏最小二乘法判别分析，PC-DA主成分判别分析。 5.根据权利要求2所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，以得到的大样本数据库为基础构建判别与预测模型，判别与预测模型先以已有数据进行训练与交叉验证，再以部分样本为测试集测试其判别和预测能力；判别和预测能力通过计算敏感性、特异性、准确率以及AUC值进行评估，若敏感性、特异性、准确率值大于90％以及AUC值大于0.9，则表明模型有良好的判别和预测能力；所述判别与预测模型包括：自主构建的人工神经网络，遗传算法，支持向量机。 6.根据权利要求1所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，基于负离子模式下的脂质指纹谱图的肾细胞癌组织判别过程如下：步骤a，将待测肾细胞癌组织样本与癌旁组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；步骤b，用硅纳米线芯片从临床组织表面进行脂质取样；脂质取样过程为：将待测样品从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并使组织具有变形，接触取样时间为5s-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测；步骤c，在负离子检测模式下获取所有临床肾组织样本在700-1200Da分子量范围内的脂质指纹谱图，在临床肾组织表面的脂质主要以硫苷脂和羟基硫苷脂分子为主；步骤d，将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有峰强度进行全谱归一化，归一化方法为以全谱范围内的信号最强峰为1，其余峰相对于信号最强峰的强度比值为各峰归一化后的数值；步骤e，将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有归一化后的峰强度进行OPLS-DA分析和双样本的t检验进行特征峰的筛选，同时满足OPLS-DA中的VIP投影变量重要度值大于设定值，和t检验中的p显著性差异值小于设定值的峰，则为能够区分肾细胞癌组织与癌旁组织的特征分子，若满足VIP>1，p<0.05的峰，则被认为是临床肾细胞癌组织表面的潜在生物标志物；步骤f，OPLS-DA会自动给出该判别方法的解释率R2Y以及表征模型的预测能力的参数Q2，两者越接近1越表明肾细胞癌组织与癌旁组织的差异性越大；若满足R2Y>0.5，Q2>0.5，则表明肾细胞癌组织与癌旁组织能够被区分开；根据肾组织样本的数据点在OPLS-DA二维图中的位置是落在肿瘤组织区还是非肿瘤组织区，来判断该样本的归属。 7.根据权利要求6所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，所述临床肾细胞癌组织表面的特征峰包括：m/z＝778.6，794.6，876.6，878.6，888.6，892.6，894.6，904.64，906.6，908.7，922.6，924.6，1024.7，1052.7。 8.根据权利要求1所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，肝细胞型肝癌组织与非癌组织的判别过程如下：步骤a，将待测的肝细胞型肝癌组织样本与癌旁、正常肝组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；步骤b，用硅纳米线芯片从临床组织表面进行脂质取样；脂质取样过程为：将待测样品从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并使组织具有变形，接触取样时间为5s-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测；步骤c，在负离子和正离子检测模式下同时获取所有临床肝组织样本的脂质指纹谱图，在临床肝组织表面的脂质包括：脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸和甘油三酯；步骤d，将临床肝组织样本的脂质指纹谱图中的相邻双峰的离子强度相除，得到所有相邻双峰的比值，相邻双峰的分子量差为2Da，以分子量较小的峰为M，则比值＝M+2峰的离子强度/M峰的离子强度；将临床肝细胞型肝癌组织与癌旁、正常肝组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有比值信息分别进行LDA线性判别分析，再用数学分析软件得到基于n维比值矩阵X的n个线性判别式，tn＝a1X1+a2X2+a3X3+…+anXn，其中a1至an构成系数矩阵，并自动计算每组样本的重心坐标点(x，y)；根据所有组织的数据点按照贡献率最高的第一线性判别式和第二线性判别式得到LDA二维图，若与癌组织重心点之间的距离小于与癌旁和正常肝组织的样本之间的距离，则被判别为癌组织；若与癌组织重心点之间的距离大于与癌旁和正常肝组织的样本之间的距离，则判别不是癌组织。 9.根据权利要求1所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，基于人工神经网络的肿瘤组织预测过程如下：步骤a，将待测肾细胞癌组织样本与癌旁组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；将待测的肝细胞型肝癌组织样本与癌旁、正常肝组织样本均从临床外科手术中获取，剪裁，清洗，记录信息后置于-80℃超低温冰箱储存，得到待测样品；步骤b，用硅纳米线芯片从临床组织表面进行脂质取样；脂质取样过程为：将待测样品从-80℃超低温冰箱中取出，置于室温下解冻，切开，使内表面暴露，将硅纳米线芯片切割，使芯片碰到组织表面并使组织具有变形，接触取样时间为5s-180s，采样结束后用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，放置于真空干燥环境中保存直至质谱检测；步骤c，在负离子检测模式下获取所有临床肾组织样本的脂质指纹谱图，在临床肾组织表面的脂质主要以硫苷脂和羟基硫苷脂分子为主；在负离子和正离子检测模式下同时获取所有临床肝组织样本的脂质指纹谱图，在临床肝组织表面的脂质包括：脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸和甘油三酯；步骤d，将临床肾细胞癌组织与癌旁组织表面获取的脂质指纹谱图中的所有峰强度经全谱归一化，归一化方法为以全谱范围内的信号最强峰为1，其余峰相对于信号最强峰的强度比值为各峰归一化后的数值；将临床肝组织样本的脂质指纹谱图中的相邻双峰的离子强度相除，得到所有相邻双峰的比值，相邻双峰的分子量差为2Da，以分子量较小的峰为M，则比值＝M+2峰的离子强度/M峰的离子强度；步骤e，将临床肾组织和临床肝组织的脂质指纹谱图中的所有分子归一化后的分子强度信息或在癌组织和非癌组织中有显著性差异的特征分子强度信息导入前反馈人工神经网络系统，为输入值，设定输出值为由0和1构成的矩阵代表组别；设定人工神经网络的训练集为所有数据的70％，验证集为15％，测试集为15％，模型自动对预测敏感性、特异性和准确率进行计算，并得到ROC曲线和AUC值；步骤f，完成人工神经网络模型建立后，用敏感性、特异性、准确率、AUC值评估该模型对肾癌组织和肝癌组织的预测能力，若敏感性、特异性、准确率值大于90％以及AUC值大于0.9，则表明模型有良好的判别和预测能力。 10.根据权利要求9所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，步骤f，完成人工神经网络模型建立后，用敏感性、特异性、准确率、AUC值评估该模型对肾癌组织和肝癌组织的预测能力，若敏感性、特异性、准确率值大于90％以及AUC值大于0.9，则表明模型有良好的判别和预测能力；若以肾癌组织表面在负离子模式下700-1100Da分子量范围内所有检测到的峰为依据，敏感性、特异性和准确率均为100％；若以肾癌组织表面在负离子模式下m/z＝778.5，794.6，876.6，878.6，892.6，904.6，906.6，922.6，924.6，888.6这9个特征峰为依据，敏感性、特异性和准确率均为100％；若以肝癌组表面负离子模式下200-1000Da和正离子模式下700-1000Da分子量范围内所有的相邻双峰比值信息为依据，敏感性、特异性和准确率分别为95.0％，99.2％和97.8％；若以肝癌组表面负离子模式下的I(m/z＝255.2)/I(m/z＝253.2)，I(m/z＝281.2)/I(m/z＝279.2)，I(m/z＝305.3)/I(m/z＝303.3)，I(m/z＝331.3)/I(m/z＝329.3)，I(m/z＝740.5)/I(m/z＝738.5)，I(m/z＝764.5)/I(m/z＝762.5)，I(m/z＝835.5)/I(m/z＝833.5)，I(m/z＝859.5)/I(m/z＝857.5)，I(m/z＝861.6)/I(m/z＝859.5)，I(m/z＝863.6)/I(m/z＝861.6)，I(m/z＝885.6)/I(m/z＝883.5)，I(m/z＝887.6)/I(m/z＝885.6)，I(m/z＝891.6)/I(m/z＝889.6)和正离子模式下的I(m/z＝739.5)/I(m/z＝737.5)，I(m/z＝804.6)/I(m/z＝802.5)，I(m/z＝855.7)/I(m/z＝853.7)，I(m/z＝877.7)/I(m/z＝875.7)，I(m/z＝881.8)/I(m/z＝879.7)，I(m/z＝903.7)/I(m/z＝901.7)，I(m/z＝905.8)/I(m/z＝903.7)，I(m/z＝907.8)/I(m/z＝905.7)，I(m/z＝909.8)/I(m/z＝907.7)共22个比值为依据，敏感性、特异性和准确率分别为96.7％，99.2％和98.3％。 11.根据权利要求1所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，基于脂质分子的数字成像及肿瘤边界判别过程如下：步骤a，从临床外科手术中获取癌组织与癌旁组织相连的组织样本，裁剪；步骤b，将硅纳米线芯片切割后，使芯片碰到组织表面并使组织具有变形，接触取样时间为5s-180s，完成顶端接触取样；步骤c，采样结束后，用纯水彻底冲洗芯片表面，待其自然干燥后转移至和质谱仪器相匹配的靶板基底，并对其表面进行图像扫描；步骤d，将靶板送入质谱仪，使其自动二维扫描，并将获得的谱图中能够代表癌组织表面的脂质分子信息、特征相邻双峰信息以及多维脂质分子信息经过PCA主成分分析、LDA线性降维变换、OPLS-DA非线性降维变换后的数据导入MATLAB进行数字成像，同时将同块组织在-10℃--20℃环境下切片，得到厚度为10-20μm的组织片完成苏木精&伊红染色，将质谱数字成像结果与苏木精&伊红组织切片染色图相对照，评价本方法用于肿瘤边界判别的可行性；苏木精&伊红显示的肿瘤区域和非肿瘤区域的颜色深浅对比及其边界轮廓与质谱的数字成像图显示的肿瘤边界进行对照，若两者的边界轮廓能够相吻合，则表明组织分子数字成像能够用于判别肿瘤边界；若两者的边界轮廓不能够相吻合，则表明组织分子数字成像的空间辨别能力不足以判别肿瘤边界；将数字成像结果与步骤四所建立的临床组织样本数据库对比，可获得相比于苏木精&伊红染色更为丰富的疾病信息，包括：肿瘤异质性信息，肿瘤亚型信息。 12.根据权利要求1或2所述的一种基于组织表面脂质指纹谱图的快速肿瘤组织判别方法，其特征在于，取样芯片进行脂质取样的取样对象包括：临床手术中的组织表面，术前穿刺样本，胃肠镜检查中获取的样本。
所属类别：	发明专利