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原文传递检测血清中四种孕激素的方法

专利名称：	检测血清中四种孕激素的方法
摘要：	本发明提供了一种血清中四种孕激素的检测方法，所述四种孕激素为：17α‑羟基孕烯醇酮、17α‑羟基孕酮、孕酮和孕烯醇酮；包括以下步骤：向血清样品中加入含内标物的甲醇溶液，进行蛋白沉淀，离心、取上清，加入衍生化试剂进行衍生化反应，冷却至室温后加入叔丁基甲醚，离心、取上清，得待测样品；所述内标物为17α‑羟基孕烯醇酮内标物、17α‑羟基孕酮内标物、孕酮内标物和孕烯醇酮内标物；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。该方法可以有效去除基质干扰，具有特异性、抗基质干扰能力强、定量限低，灵敏度高的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广州博厚健康科技有限公司
发明人：	何翠红;卢章准;麦嘉颖;叶顺兰;汤习锋
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910652773.0
公开号：	CN110243977A
代理机构：	广州华进联合专利商标代理有限公司
代理人：	向薇
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	510700 广东省广州市黄埔区科丰路31号G7栋501房
主权项：	1.一种血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：所述四种孕激素为：17α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮、孕酮和孕烯醇酮；前处理：向血清样品中加入含内标物的甲醇溶液，进行蛋白沉淀，离心、取上清，加入衍生化试剂进行衍生化反应，冷却至室温后加入叔丁基甲醚，离心、取上清，得待测样品；所述内标物为17α-羟基孕烯醇酮内标物、17α-羟基孕酮内标物、孕酮内标物和孕烯醇酮内标物；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。 2.根据权利要求1所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，所述富集、分离和检测的步骤包括：采用第一流动相洗脱第一维色谱柱，对所述待测样品进行富集，得富集后的样品；采用第二流动相将所述富集后的样品从所述第一维色谱柱洗脱至第二维色谱柱，分离、检测；所述第一流动相包括A相和B相，所述A相为水，所述B相为甲醇；所述第二流动相包括C相和D相，所述C相为含体积百分比为(0.1±0.01)％甲酸的去离子水溶液，所述D相为含体积百分比为(0.1±0.01)％甲酸的甲醇溶液。 3.根据权利要求2所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，所述第一维色谱柱为C6-Phenyl柱，所述第二维色谱柱为C18柱；和/或所述第一流动相的流速为0.5～1.5ml/min；所述第二流动相的流速为0.2～1.0ml/min。 4.根据权利要求1-3任一项所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，二维液相色谱采用梯度洗脱的模式： 0min～0.2min时，采用所述第一流动相洗脱所述第一维色谱柱，对所述待测样品进行富集，所述第一流动相中A相与B相的体积比为(60±3):(40±3)； 0.2min时，将所述第一维色谱柱与所述第二维色谱柱连通； 0.2min～0.5min时，采用所述第二流动相将富集后的样品从所述第一维色谱柱洗脱至所述第二维色谱柱；所述第二流动相中C相与D相的体积比为(60±3):(40±3)； 0.5min～2min时，所述第二流动相中C相与D相的体积比为(60±3):(40±3)； 2min～3.6min时，所述第二流动相中C相与D相的体积比为(50±3):(50±3)； 3.6min～4.4min时，所述第二流动相中C相与D相的体积比为(30±3):70±3)； 4.4min～7.1min时，所述第二流动相中C相与D相的体积比为(5±3):(95±3)； 7.1min后，所述第二流动相中C相与D相的体积比为(60±3):(40±3)；洗脱至第8.0-9.0min。 5.根据权利要求1-3任一项所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，所述17α-羟基孕烯醇酮内标物为17α-羟基孕烯醇酮的C13标记物或氘代标记物；所述17α-羟基孕酮内标物为17α-羟基孕酮的C13标记物或氘代标记物；所述孕酮内标物为孕酮的C13标记物或氘代标记物；所述孕烯醇酮为孕烯醇酮的C13标记物或氘代标记物。 6.根据权利要求1-3任一项所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，所述前处理中：所述血清样品与所述含内标物的甲醇溶液的体积比为1：1～4；及/或所述血清样品与所述叔丁基甲醚的体积比为1：2～4；及/或所述叔丁基甲醚与所述血清样品经蛋白沉淀后的上清液的体积比为1：1～2；及/或所述衍生化试剂为盐酸羟胺；及/或所述衍生化反应的条件为：温度60-90℃，时间30-60min。 7.根据权利要求6所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，所述盐酸羟胺溶液的浓度为1.0-2.0mol/L。 8.根据权利要求1-4任一项所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；所述正离子模式中，目标定量离子对包括17α-羟基孕烯醇酮定量离子对、17α-羟基孕酮定量离子对、孕酮定量离子对和孕烯醇酮定量离子对；和/或 17α-羟基孕烯醇酮内标物的定量离子对、17α-羟基孕酮内标物的定量离子对、孕酮内标物的定量离子对和孕烯醇酮内标物的定量离子对；所述目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：孕烯醇酮的母离子的质/荷比为332.0～332.5，对应的子离子的质/荷比为330.0-330.5，95.8～96.4； 17α-羟基孕酮的母离子的质/荷比为360.5～361.5，对应的子离子的质/荷比为123.8-124.4，111.7～112.3；孕酮母离子的质/荷比为344.9～345.5，对应的子离子的质/荷比为123.6～124.2，111.9-112.4； 17α-羟基孕烯醇酮母离子的质/荷比为348.0-348.6，对应的子离子的质/荷比为329.7-330.3，311.9～312.5； 17α-羟基孕酮内标物的母离子的质/荷比为369.0-369.6，对应的子离子的质/荷比为127.8-128.4；所述17α-羟基孕酮内标物为17α-羟基孕酮-D8；孕酮内标物母离子的质/荷比为354.1～354.7，对应的子离子的质/荷比为127.7-128.3；所述孕酮内标物为孕酮-D9；孕烯醇酮内标物母离子的质/荷比为336.1-336.7，对应的子离子的质/荷比为89.8-90.4；所述孕烯醇酮内标物为孕烯醇酮-D4； 17α-羟基孕烯醇酮内标物母离子的质/荷比为351.0-351.7，对应的子离子的质/荷比为329.9-333.5；所述17α-羟基孕烯醇酮内标物为17α-羟基孕烯醇酮-D4。 9.根据权利要求8所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为30～40psi，加热气压力为35～45psi，辅助加热气压力为50～60psi，加热气温度为450～600℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为7.5～12psi，电喷雾针电压为4000～5500V。 10.根据权利要求8所述的血清中四种孕激素的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括：孕烯醇酮定量离子对的去簇电压为140～160V，入口电压为6～9V，碰撞电压为40～50V，出口电压为10～14V；17α-羟基孕酮的定量离子对的去簇电压为160～180V，入口电压5～7V，碰撞电压为40～50V，出口电压为8～12V；孕酮定量离子对的去簇电压为170～180V，入口电压8～12V，碰撞电压为38～45V，出口电压为8～12V；17α-羟基孕烯醇酮定量离子对的去簇电压为80～110V，入口电压6～10V，碰撞电压为13～22V，出口电压为8～12V；17α-羟基孕酮-D8定量离子对的去簇电压为185～200V，入口电压7～12V，碰撞电压为40～50V，出口电压为8～12V；孕酮-D9定量离子对的去簇电压为140～180V，入口电压8～14V，碰撞电压为30～45V，出口电压为9～13V；孕烯醇酮-D4定量离子对的去簇电压为130～150V，入口电压10～14V，碰撞电压为35～50V，出口电压为6～10V；17α-羟基孕烯醇酮-D4定量离子对的去簇电压为90～110V，入口电压6～10V，碰撞电压为15～25V，出口电压为12～18V。
所属类别：	发明专利