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原文传递一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法

专利名称：	一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法
摘要：	本发明属于动物免疫学技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法。本发明以抗产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体包被酶标板，以天然产气荚膜梭菌β毒素作为捕获抗原，建立产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法。本发明具有快速简便、特异性强、灵敏度高等特点，适用于产气荚膜梭菌β毒素抗体的检测、流行病学调查及疫苗免疫效果评价等方面。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东农业大学
发明人：	王海荣;陈端;楚国茹;柴同杰;陈勇;钟招兵
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-20T00:00:00+0800
申请号：	CN201910588429.X
公开号：	CN110261606A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	薛鹏喜
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	271018 山东省泰安市岱宗大街61号
主权项：	1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.14894。 2.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌产生。 3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的试剂盒中的应用。 4.一种检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。 5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒中还包含有：抗原包被液、封闭液、捕获抗原、二抗、阳性对照血清和阴性对照血清。 6.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述抗原包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6。 7.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液的组成为：5g脱脂奶粉溶于100ml PBST中。 8.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述捕获抗原由如下方法制备而成：将C型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，厌氧培养，选取厌氧培养后的单个的菌落接种至液体硫乙醇培养基进行増菌培养；然后将増菌液接种于改良的Gordon汤中，45℃培养4-6h产毒，将培养物离心后过滤除菌，得到除菌后的C型产气荚膜梭菌外毒素；将外毒素进行纯化，即制备得到捕获抗原。 9.根据权利要求8所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤绵羊血；所述改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g、糊精1g、酵母提取物2g、L-精氨酸1.2g、葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌，即得。 10.一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)包被：将保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml，每孔100μL，加入到96孔酶标板，4℃密封过夜； (2)封闭：将包被后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，洗涤后加入封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜； (3)加抗原：将封闭后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，每孔加入用PBS缓冲液稀释至2μg/ml的捕获抗原100μL，37℃孵育1h； (4)加待检血清：将步骤(3)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的待检血清，每孔100μL，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照，其中，阴性对照加入阴性对照血清，阳性对照加入阳性对照血清，空白对照加入PBS缓冲液；37℃孵育1h； (5)加二抗：将步骤(4)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h； (6)显色：将步骤(5)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，加入TMB底物显色液100μL/孔，37℃条件下避光反应15min； (7)终止：每孔加入100μL 2M H2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值； (8)结果判定：计算阴性样品平均值与标准差(SD)，求得为阳性临界值，为阴性临界值；测定待检血清的OD450nm，若待检血清的为阳性，为阴性，为可疑样品。
所属类别：	发明专利