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原文传递一种探针及其应用

专利名称：	一种探针及其应用
摘要：	本发明提供了一种探针及其应用，所述探针包括间隔臂和连接于所述间隔臂上的诱饵蛋白、光反应基团和富集基团，其中诱饵蛋白包括识别特定蛋白质翻译后修饰的蛋白质结构域，例如识别酪氨酸磷酸化的SH2结构域；本发明的探针不影响目标蛋白活性，当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时，紫外光辐射促进了光反应基团与目标蛋白的共价结合，通过富集基团有效富集得到蛋白复合物，有利于进行蛋白质间弱相互作用和瞬时相互作用分析，显著提高了人或动物组织样本及细胞膜附近目标蛋白及其复合物的富集和鉴定能力，成功实现对不同乳腺癌细胞系中和乳腺癌组织内的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定，具有广阔的应用前景和市场价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	南方科技大学
发明人：	田瑞军;李鹏飞;初碧珠;何岸;郑振东
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910599017.6
公开号：	CN110231490A
代理机构：	北京品源专利代理有限公司
代理人：	巩克栋
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	518000 广东省深圳市南山区西丽学苑大道1088号
主权项：	1.一种探针，其特征在于，所述探针包括间隔臂和连接于所述间隔臂上的诱饵蛋白、光反应基团和富集基团。 2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述间隔臂包括赖氨酸，优选为L-赖氨酸；优选地，所述诱饵蛋白包括含有SH2结构域的蛋白和/或多肽，优选为SH2结构域，进一步优选为突变型SH2结构域；优选地，所述突变型SH2结构域为Src SH2结构域突变体，所述突变体是在野生型SrcSH2结构域的基础上对SH2结构域内第138位的苏氨酸替换为缬氨酸、第188位的半胱氨酸替换为丙氨酸、第206位的赖氨酸替换为亮氨酸；优选地，所述光反应基团包括联苯二甲酮、芳基叠氮化物或二氮嗪中的任意一种；优选地，所述富集基团包括生物素；优选地，所述SH2结构域通过游离的伯氨基和/或巯基连接于所述间隔臂上的NHS基团和/或I基团。 3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，所述探针中与SH2结构域结合的探针骨架如通式I和/或通式II所示：其中，n1选择0、1或2，n2选择0、1或2，R选自优选地，n1为0，n2为0，R为优选地，n1为1，n2为2，R为优选地，n1为1，n2为2，R为优选地，n1为1，n2为2，R为 4.一种如权利要求1-3任一项所述的探针在检测蛋白质间相互作用中的应用，优选为在检测含有酪氨酸磷酸化残基的蛋白质间相互作用中的应用。 5.一种蛋白质间相互作用的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)向待测样品中加入如权利要求1-3任一项所述的探针，混合后孵育； (2)将孵育的产物进行光辐射； (3)加入微球后孵育、清洗，进行蛋白分析。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述孵育的温度为2-6℃；优选地，步骤(1)所述孵育的时间为1.5-2.5h；优选地，步骤(2)所述光辐射的波长为360-370nm；优选地，步骤(2)所述光辐射的时间为10-60min；优选地，步骤(3)所述微球修饰有链霉亲和素；优选地，步骤(3)所述孵育的温度为2-6℃；优选地，步骤(3)所述孵育的时间为1.5-2.5h；优选地，步骤(3)所述清洗采用优化的RIPA缓冲液和/或碳酸氢铵溶液；优选地，步骤(3)所述蛋白分析包括免疫印迹分析和/或质谱分析。 7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1)向待测样品中加入如权利要求1-3任一项所述的探针，混合后在2-6℃下孵育1.5-2.5h； (2)将孵育的产物在360-370nm下光辐射10-60min； (3)加入链霉亲合素微球，在2-6℃下孵育1.5-2.5h，采用优化的RIPA缓冲液和/或碳酸氢铵溶液清洗后，对得到的蛋白进行免疫印迹分析和质谱分析。 8.一种高通量的蛋白质间相互作用的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1’)将如权利要求1-3任一项所述的探针固定在固相载体上，加入待测样品，混合后孵育； (2’)将孵育的产物进行光辐射，进行蛋白分析。 9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(1’)所述固相载体上修饰有链霉亲和素；优选地，所述固相载体包括96孔细胞培养板、384孔细胞培养板或载玻片中的任意一种，优选为96孔细胞培养板或384孔细胞培养板；优选地，步骤(1’)所述固定的温度为2-6℃；优选地，步骤(1’)所述固定的时间为1.5-2.5h；优选地，步骤(1’)所述待测样品包括细胞裂解液；优选地，所述细胞裂解液与所述探针的质量比为(1～200):1，优选为(10～100):1；优选地，步骤(1’)所述孵育的温度为2-6℃；优选地，步骤(1’)所述孵育的时间为1.5-2.5h；优选地，步骤(2’)所述光辐射的波长为360-370nm；优选地，步骤(2’)所述光辐射的时间为1-60min，优选为10-30min；优选地，在步骤(2’)光辐射后采用洗涤缓冲液进行洗涤；优选地，所述洗涤缓冲液为包含0-10mol/L尿素的mRIPA洗涤缓冲液。 10.一种正向蛋白阵列，其特征在于，所述正向蛋白阵列由固相载体与固定在所述固相载体上的如权利要求1-3任一项所述的探针组成；优选地，所述探针通过富集基团固定在固相载体上；优选地，所述固相载体上修饰有链霉亲和素；优选地，所述固相载体包括96孔细胞培养板、384孔细胞培养板或载玻片中的任意一种，优选为96孔细胞培养板或384孔细胞培养板。
所属类别：	发明专利