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原文传递一种NAD+生物发光探针及其应用

专利名称：	一种NAD+生物发光探针及其应用
摘要：	本发明公开了一种NAD+生物发光探针及其应用。本发明公开的NAD+生物发光探针具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并进一步公开所述NAD+生物发光探针在检测NAD+浓度中的应用或在检测CD38酶活性中的应用或在筛选CD38酶活性调控药物中的应用或在CD38酶活性调控药物的药物效果评估中的应用。本发明首次利用了NAD+生物发光探针实时测量CD38酶反应体系中的NAD+浓度，用NAD+的消耗速率表征CD38的酶活性强弱，创新性地实现了CD38酶活性检测体系中NAD+浓度的直接、实时、无干扰监测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	深圳先进技术研究院
发明人：	段若晨;於邱黎阳
专利状态：	有效
申请日期：	2022-05-18T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-28T00:00:00+0800
申请号：	CN202210540324.9
公开号：	CN117129664A
代理机构：	北京市诚辉律师事务所
代理人：	范盈
分类号：	G01N33/53;G01N33/58;G01N33/533;C12Q1/34;C12Q1/48;G01N21/76;G;C;G01;C12;G01N;C12Q;G01N33;C12Q1;G01N21;G01N33/53;G01N33/58;G01N33/533;C12Q1/34;C12Q1/48;G01N21/76
申请人地址：	518055 广东省深圳市南山区西丽大学城学苑大道1068号
主权项：	1.一种NAD+生物发光探针，其特征在于，所述NAD+生物发光探针具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。 2.编码权利要求1所述NAD+生物发光探针的核苷酸序列。 3.权利要求1所述的NAD+生物发光探针在检测NAD+浓度中的应用或在检测CD38酶活性中的应用或在筛选CD38酶活性调控药物中的应用或在CD38酶活性调控药物的药物效果评估中的应用；所述CD38酶活性调控药物包括CD38激活剂或CD38抑制剂。 4.一种NAD+浓度的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述NAD+生物发光探针和生物发光探针底物。 5.一种CD38酶活性的生物发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述NAD+生物发光探针、β-NAD、MES缓冲液、生物发光探针底物和高氯酸。 6.一种CD38酶活性调控药物的筛选或药效评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述NAD+生物发光探针、β-NAD、MES缓冲液、生物发光探针底物、高氯酸和CD38。 7.一种检测NAD+浓度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： S1.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线； S2.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与待测样本混合，测量待测样本在440nm和580nm两波长下的光强比值； S3.在标准曲线上回归获得待测样本对应的NAD+浓度。 8.一种CD38酶活性的生物发光检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤： S1.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线； S2.通过方法(1)或方法(2)测量待测样本反应体系在不同时间点的440nm和580nm两波长光强比值；方法(1)：将包含MES缓冲液、β-NAD和待测样本的反应液混匀，置于37℃下反应，设置适当时间间隔，每隔一段时间取适量反应液，用高氯酸处理，终止反应，将处理后的反应液与权利要求1所述生物发光探针和探针底物混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长处的发光强度，计算每个时间点的光强比值；方法(2)：将包含MES缓冲液、权利要求1所述生物发光探针、β-NAD、探针底物、待测样本，按次序混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长发光强度在一段时间内、适当时间间隔的动态变化，计算每个时间点的光强比值； S3.根据步骤S1制作的标准曲线和步骤S2测量的待测样本反应体系每个时间点的光强比值，对应求得反应体系中每个时间点的NAD+浓度，将NAD+浓度同反应时间作图，利用线性回归确定反应体系中的NAD+消耗速率，即为CD38的酶活性。 9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，方法(1)中： 100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、20-200μMβ-NAD和待测样本；所述高氯酸的浓度为0.5N，所取反应液与高氯酸的体积比为1:4； 10μl所述处理后的反应液中加入的生物发光探针量为0.1-20nM；方法(2)中：100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、0.1-20nM生物发光探针、20-200μMβ-NAD、探针底物和待测样本；优选地，方法(1)和方法(2)中所述MES缓冲液的pH为6.5；优选地，方法(1)中所述时间间隔为10min；优选地，方法(2)中所述时间间隔为1min；优选地，所述待测样本包括生物样本；优选地，所述生物样本包括生物细胞或组织。 10.一种CD38酶活性调控药物的筛选方法或CD38酶活性调控药物的药效评估方法，其特征在于，包括如下步骤： S1.采用权利要求1所述NAD+生物发光探针与不同标准浓度的NAD+混合，测量不同浓度NAD+下440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值，利用不同浓度NAD+下测得的440nm和580nm两波长光强比值对应NAD+浓度作出标准曲线； S2.通过方法(1)或方法(2)测量实验组和对照组反应体系反应一段时间后的440nm和580nm两波长光强比值，其中，实验组反应体系中加入待测药物，对照组反应体系中不加入待测药物；方法(1)：将包含MES缓冲液、β-NAD、CD38和待测药物的反应液混匀或将包含MES缓冲液、β-NAD和CD38的反应液混匀，置于37℃下反应一段时间，取适量反应液，用高氯酸处理，终止反应，将处理后的反应液与权利要求1所述生物发光探针和探针底物混合，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长处的发光强度，计算光强比值；方法(2)：将包含MES缓冲液、权利要求1所述生物发光探针、β-NAD、探针底物、CD38和待测药物或将包含MES缓冲液、权利要求1所述生物发光探针、β-NAD、探针底物和CD38，按次序混合，反应一段时间，放入酶标仪中检测，用生物发光检测功能测量440nm和580nm两波长发光强度，计算光强比值； S3.根据步骤S1制作的标准曲线和步骤S2测量的反应体系的光强比值，对应反应一段时间后反应体系中的NAD+浓度，计算NAD+的消耗量，最终计算实验组较对照组NAD+消耗量比率(Ratio)；当Ratio＞1时，所述待测药物为潜在的CD38激活剂，且Ratio值越大，待测药物的药效越强；当Ratio＜1时，所述待测药物为潜在CD38的抑制剂，且Ratio值越小，待测药物的药效越强；当Ratio＝1时，所述待测药物不会影响CD38催化的NAD+消耗。 11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，方法(1)中： 100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、20-200μMβ-NAD、0.1-10ng/μl CD38和0.01-500μM待测药物；所述高氯酸的浓度为0.5N，所取反应液与高氯酸的体积比为1:4； 10μl所述处理后的反应液中加入的生物发光探针量为4nM；方法(2)中：100μl所述反应液包含50mM MES缓冲液、0.1-20nM生物发光探针、20-200μMβ-NAD、0.1-10ng/μl CD38和0.01-500μM待测药物；优选地，方法(1)和方法(2)中所述MES缓冲液的pH为6.5；优选地，方法(1)和方法(2)中所述反应时间为1h。
所属类别：	发明专利