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原文传递一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统

专利名称：	一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统
摘要：	本发明属于单分子成像技术领域，具体涉及一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。本发明系统包括：第一物镜、第二物镜、第一平面、第二平面、第一平面镜、凹面镜、第二平面镜、EMCCD；本发明在基本倒置荧光显微镜高速二维探测系统的基础上，通过搭建第二物镜，收集上半球面的荧光信号至第二平面，再由第二平面上的凹面镜返还至样品平面；经过第二物镜放大后，使单分子信号离凹面镜的中心轴的距离与凹面镜焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	复旦大学
发明人：	马炯;刘晓兰
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910487662.9
公开号：	CN110231320A
代理机构：	上海正旦专利代理有限公司
代理人：	陆飞;陆尤
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	200433 上海市杨浦区邯郸路220号
主权项：	1. 一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，包括：第一物镜M1（1）、样品平面（2）、支架（3）、光学平板（4）、第二物镜M2（5）、第一平面镜（6）、凹面镜M3（7）、第二平面镜（8）、EMCCD（11）；其中，光学平板（4）也称为第二平面，第二平面上放置第一平面镜（6）、凹面镜M3（7）、第二平面镜（8）、三角镜架（9）、L型镜架（10）；第一物镜M1（1）和第二物镜M2（5）相对放置，组成倒置荧光显微镜；其中间为显微镜的载物台样品平面（2），称之为第一平面；记S1为原始荧光信号，S2为S1经过第二物镜M2（5）后的像点，S3为像点S2经过凹面镜（7）后的成像点，S4为S3再次经过第二平面镜（8）和第二物镜M2（5）后的成像点；第一物镜M1（1）用于收集标准单分子荧光信号S1的下半球面荧光并成像；光学平板（4）放置于支架（3）上；所述第二物镜M2（5）用于收集荧光信号S1的上半球面荧光并成像；第一平面镜（6）按第二平面水平正方向45度角度架设，并由三角镜架（9）固定，第一平面镜（6）将第二物镜M2（5）收集的荧光反射并在点S2处聚焦成像；所述凹面镜M3（7）放置于第一平面镜（6）的反射光路上，并由一L型镜架（10）固定；像点S2由凹面镜M3（7）的成像原理形成放大的像S3；所述第二平面镜（8）放置于凹面镜M3（7）的反射光路中，通过调节第二平面镜（8）合适的角度进行修正，使得第二平面镜（8）反射的像S3返还至第二物镜M2（5）；第二物镜M2（5）将像S3缩小至样品平面（2）形成像点S4，同时显示在二维EMCCD（11）阵列探测器的焦平面上，在同一EMCCD（11）上同时获得S1和S4两个单分子荧光点；经过第二物镜M2（5）放大后，使得单分子信号离凹面镜M3（7）的中心轴的距离与凹面镜M3（7）焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度；当单分子运动时，通过对运动前后的、由凹面镜M3（7）返还的两个荧光点以及第一物镜M1收集的下半球面原荧光信号点S1的平面相对位置的分析，能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息，原荧光点S1的（x ，y）位置信息可通过二维高斯拟合获得。 2.根据权利要求1所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，单分子上下半球的荧光分别被上、下两个物镜即第一物镜M1（1）和第二物镜M2（5）捕捉，上半球被捕捉的荧光信号，通过第一平面镜（6）、第二平面镜（8）、凹面镜M3（7）组合系统放大后再返回到第一物镜M1（1）上，第一物镜M1（1）捕捉到的荧光信号S1与返还荧光点S4同时显示在EMCCD上。 3.根据权利要求2所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，上、下2个物镜，通过机械结构搭建，样品位于两个物镜之间，能容纳一定大小范围的样品尺寸，以便满足实验要求。 4.根据权利要求3所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，所述的第一平面镜（6）、第二平面镜（8）、凹面镜M3（7）组合系统，通过光学平板以及各种支架搭建，独立于外界系统，以达到减小振动的目的。 5.根据权利要求1-4之一所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，通过调节第二物镜M2（5）的工作距离，使得样品所成像在凹面镜M3（7）的两倍焦距处，则初始荧光信号与返还荧光信号位置一致，记录此时在EMCCD（11）处的返还点的位置为原点；在调节第二物镜M2（5）的焦距时，需使两个物镜同步移动，确保返还荧光点与原荧光点保持同焦平面；沿Z轴移动样品，则样品与第二物镜M2（5）的距离发生改变，通过第二物镜M2（5）所成像位置发生改变，样品离第二物镜M2（5）越近，所成的像距离凹面镜M3（7）也越近，则经过凹面镜M3（7）所成的像在EMCCD（11）上所成荧光点位置也不同，根据运动时返还荧光点与原荧光点的相对位置分析，便能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息，原荧光点S1的（x,y）位置信息可通过二维高斯拟合获得。 6.根据权利要求1-4之一所述的亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，所述的平面镜经过镀膜，以减少荧光信号损失；所述的凹面镜经过镀膜和位置、角度调节，最大化消球差和色差，并增强荧光信号。
所属类别：	发明专利