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原文传递肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用

专利名称：	肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用
摘要：	本发明属肾病综合征标志物筛选鉴定技术领域，提供一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物及其应用。双（4‑乙基苄基）山梨醇,C16二氢鞘氨醇,溶血磷脂酰乙醇胺(22:6),溶血磷脂酰胆碱(22:5),N‑乙醇胺,脯氨酸为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S‑羟基‑二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和(18:1) 为早期标志物；酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL‑色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3‑吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇‑1‑磷酸，L‑苏式 ‑ 二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)为晚期标志物。可量化，快速灵敏度高、特异性强。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山西;14
申请人：	山西大学
发明人：	秦雪梅;杨柳;李爱平;张王宁;张丽增
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910509827.8
公开号：	CN110286189A
代理机构：	太原晋科知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	郑晋周;翟冲燕
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	030006 山西省太原市坞城路92号
主权项：	1.一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物，其特征在于：所述代谢标志物为双（4-乙基苄基）山梨醇, C16二氢鞘氨醇, 溶血磷脂酰乙醇胺(22:6), 溶血磷脂酰胆碱(22:5),N-乙醇胺, 脯氨酸作为进展性标志物；油酸酰胺，二十二碳六烯酸，14S-羟基-二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸，尿酸，溶血磷脂酰胆碱(20:5)和溶血磷脂酰胆碱(18:1) 作为早期标志物；酰基肉毒碱 C18:0，亚油酸肉碱，溶血磷脂酰胆碱(18:3)，DL-色氨酸，吲哚丙烯酸，对甲酚硫酸盐，3-吲哚硫酸盐，胞嘧啶，肌酸酐，鞘氨醇-1-磷酸，L-苏式 - 二氢鞘氨醇和神经酰胺(d18:0/14:0)作为晚期标志物。 2.筛选权利要求1所述的一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，其特征在于：步骤如下：（1）两种阿霉素肾病模型的复制与传统评价：将大鼠随机分为空白对照组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组采用尾静脉注射阿霉素进行诱导，建立阿霉素肾病模型；利用肾组织病理损伤程度与尿蛋白定量水平对阿霉素肾病模型进行评价；（2）差异代谢物的寻找：在不同时间阶段收集各组大鼠的血清样品，对血清进行LC-MS分析，归属出代谢物；液质图谱经处理转换为数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行差异代谢物寻找；（3）结合统计方法筛选、确定反映肾病综合征病变进程的标志物；（4）基于代谢物的相对含量，采用热图、相关分析图对代谢物进行确证，并采用ROC曲线对标志物的诊断能力进行评估，最终确定出反应肾病综合征模型的早期、晚期和进展性标志物。 3.根据权利要求2所述的筛选肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，其特征在于：步骤（1）中两种阿霉素肾病模型的复制的具体方法为：大鼠适应环境一周，收集大鼠24h的尿液，并记录尿液体积；以大鼠的尿蛋白定量和体重为依据进行初筛，将合格大鼠随机分为空白对照组与早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组，实验过程中自由饮水进食；早期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天尾静脉注射4 mg/kg的阿霉素，随后隔1周，于第8天尾静脉注射2 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病早期模型；晚期阿霉素肾病模型组大鼠于第1天一次性尾静脉注射6 mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病晚期模型；空白对照组以相同的方式给予等剂量的生理盐水；在模型复制过程中，分别于第0天、第7天、第14天、第28天、第42天早上9:00将空白对照组和早期和晚期阿霉素肾病模型组大鼠分别置于大鼠代谢笼中，于次日早上9:00收集尿液，并记录尿液体积，对收集的尿液样品于4℃，3500 rpm离心15 min后取上清液，置于-80℃冰箱备用；对尿液采用双辛丁酸BCA法进行尿蛋白定量分析，在562 nm处定量测定大鼠24 h尿液吸光度，依据标准曲线计算尿液蛋白浓度，通过将尿蛋白浓度mg/mL乘以24 h尿体积mL来计算24 h尿蛋白排泄量Upro。 4.根据权利要求2所述的筛选肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，其特征在于：血清样品进行LC-MS分析具体方法为：采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极，3.5kV；负极，2.5kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z100-1500，正离子切换采集模式；分辨率采用MSFull Scan 35000 FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV；所有原始文件，包括C1组与M1组和M2组，都是通过Xcalibur 工作站和CompoundDiscover 2.0导出的，得到了一个独立的峰值表m/z和保留时间；所有样品均采用以下参数进行研究：S/N阈值：3，质量范围：100~1500 Da，质量公差：5 ppm。 5.根据权利要求2所述的筛选肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，其特征在于：步骤（2）中血清样品数据处理方法为：将数据矩阵导入SIMCA-P 13.0软件中，以空白对照组与早期和晚期阿霉素肾病模型组构建无监督的模式识别主成分分析PCA；以空白对照组与早期阿霉素肾病模型组和晚期阿霉素肾病模型组构建偏最小二乘法判别分析PLS-DA，以排列实验评价模型的可靠性，并用于后续差异代谢物的鉴定；构建V+S-plotcoefficient>0.7结合VIP>1寻找对二者分组贡献较大的差异代谢物，通过t-test（p<0.05）确定具有显著性的差异代谢物。 6.根据权利要求2所述的筛选肾病综合征病变进程相关代谢标志物的方法，其特征在于：步骤（3）具体方法为：根据S-plot和VIP值，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为鉴定的差异物标志物；将早期和晚期模型均有的差异代谢物认为是进展性标志物；根据S-plot和VIP值，对空白对照组和早期阿霉素肾病模型组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为潜在早期标志物；以上述潜在早期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择相关分析方法，计算二者的相关系数，确定早期标志物；依据ROC曲线下面积，以AUC>0.7的代谢物作为反映肾病综合征的早期标志物；根据S-plot和VIP值，对空白对照组和晚期阿霉素肾病模型组进行分析，选定具有统计学显著差异的质谱离子VIP>1.0及P<0.05，确定为潜在晚期标志物；以上述潜在晚期标志物和大鼠尿蛋白定量为变量，通过判别每组数据的数据特征，选择相关分析方法，计算二者的相关系数，确定晚期标志物；依据ROC曲线下面积，以AUC>0.7的代谢物作为反映肾病综合征的晚期标志物。 7.权利要求1所述的一种肾病综合征病变进程相关代谢标志物的应用，其特征在于：所述代谢标志物在制备肾病综合征病变进程诊断鉴别试剂中的用途。
所属类别：	发明专利