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原文传递一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法

专利名称：	一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法
摘要：	本发明公开了一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，包括如下步骤：(1)提取绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，再与缓冲液混合后高温变性，制备SDS‑PAGE凝胶，先分离胶灌胶密封凝聚，再加入浓缩胶，后加电泳缓冲液进行电泳；(2)电泳完成后找出目的蛋白凝胶，剪取PVDF膜，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由外向里的顺序置于转膜仪中，采用低温高压双层膜湿转膜进行对蛋白转印；(3)转膜结束后加入5％脱脂奶粉封闭液；(4)加入稀释后的一抗和二抗免疫反应；(5)显色。本发明采用低温高压双层膜湿转膜对绵羊卵巢组织血管发生相关蛋白进行转膜，提高了转膜效率，节省时间，洗膜后检测条带背景清晰且信号好。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	甘肃;62
申请人：	甘肃农业大学
发明人：	王欣荣;李明娜;郭亚军
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201910462868.6
公开号：	CN110296981A
代理机构：	北京中誉威圣知识产权代理有限公司
代理人：	席勇
分类号：	G01N21/78(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	730070 甘肃省兰州市安宁区营门村1号
主权项：	1.一种绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)提取目的蛋白及进行电泳：提取绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白，采用BCA试剂盒测定所述蛋白浓度后分装于离心管中-80℃保存，制备SDS-PAGE凝胶，6％或12％分离胶灌胶后用乙醇密封，待分离胶凝聚，加入5％浓缩胶，按所述蛋白与5×SDS上样缓冲液在离心管中混合后，置于95℃水浴锅中变性10min，再与预染指示剂一同上样，加入1×电泳缓冲液，进行电泳； (2)转膜：电泳完成后，找出目的蛋白凝胶块并从玻璃板中取下，剪取PVDF膜，按照滤纸、PVDF膜、胶、滤纸由外向里的顺序排列于转膜仪中并清除所产生的气泡，采用低温高压双层膜湿转膜80V转膜75min或120V转膜90min； (3)封闭：转膜结束后加入5％脱脂奶粉封闭液室温摇床轻摇40min； (4)免疫反应：加入稀释后的一抗4℃过夜10h，用PBST洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗3次；加入稀释后的二抗37℃孵育2h，洗涤液洗去未结合的抗体，10min/次，漂洗5次； (5)显色：加入90～100μL底物发光液显影曝光，在X-胶片上中观察蛋白的表达。 2.如权利要求1所述的绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤(1)中，采用液氮研磨法和蛋白裂解液提取所述绵羊卵巢组织血管发生相关因子蛋白。 3.如权利要求1所述的绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述电泳过程中，开始电泳时恒压40V，待样品跑至两胶分离处并充分压至线性时，将电压调至80V～100V，再继续电泳直至指示剂跑至凝胶底部。 4.如权利要求1所述的绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PVDF膜先经甲醇活化1min，再按顺序放入转膜仪中。 5.如权利要求1所述的绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述一抗抗体经5％脱脂奶粉稀释的比例为1:500。 6.如权利要求1所述的绵羊卵巢血管发生相关因子蛋白的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述二抗抗体经5％脱脂奶粉稀释的比例为1:3000。
所属类别：	发明专利