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一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法
| 专利名称： | 一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法 |
| 摘要： | 本发明公开了一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法,包括步骤：S1、样品制备及凝胶电泳，在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合，电压80V进行电泳；S2、转膜，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭，将PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min；S4、加一抗，加入一抗，24℃摇床孵育2h，PBST漂洗4次，5min/次；S5、加二抗，加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，PBST漂洗4次，5min/次；S6、显色，将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，进行凝胶显影。本发明在磷酸化蛋白质的免疫印迹检测中采用湿转膜方式，蛋白信号连续且强度高；一抗抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带，蛋白信号效果较好。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 陕西;61 |
| 申请人： | 西安交通大学;苏州拜恩翰斯生物医药有限公司 |
| 发明人： | 刘华东;祁红斌;王震;刘健康 |
| 专利状态： | 有效 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201810281645.5 |
| 公开号： | CN108241065A |
| 代理机构： | 苏州国诚专利代理有限公司 32293 |
| 代理人： | 李凤娇 |
| 分类号： | G01N33/68(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68 |
| 申请人地址： | 710048 陕西省西安市咸宁西路28号 |
| 主权项： | 1.一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样品制备及凝胶电泳：在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合样品；电泳装置中加入1倍电泳缓冲液，将预染指示剂和磷酸化蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，电压80V进行电泳；S2、转膜：切取S1步骤中的磷酸化蛋白样品的电泳凝胶，并剪取两块和PAGE胶相同大小的厚滤纸和孔径为0.2μm的PVDF膜，转印夹负极放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，组装好转印夹放入转印槽，加入预冷的转移缓冲液，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭：将S2步骤中的PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min，封闭膜上剩余的疏水结合位点；S4、加一抗：在S3步骤的溶液中加入合适比例的一抗，24℃摇床孵育2h，使目的蛋白与一抗特异性结合，PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的一抗；S5、加二抗：在S4步骤的溶液中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，使HRP标记的二抗与一抗充分结合；PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的二抗；S6、显色：使用1mL加样枪将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，放入凝胶成像仪中进行凝胶显影。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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