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原文传递一种古代丝织品的免疫印迹检测方法

专利名称：	一种古代丝织品的免疫印迹检测方法
摘要：	本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种古代丝织品的免疫印迹检测方法，本发明先利用现代桑蚕丝丝素样品制备特异性单克隆抗体，然后利用固定化木瓜蛋白酶对桑蚕丝抗体进行酶解，得到具有较高活性的Fab抗体片段，将该片段与金纳米粒子复合，得到具有高特异性和灵敏性的Fab‑BM‑Au NP复合物，并将该复合物应用在古代丝织品检测领域，免疫印迹实验结果表明，该复合物能有效地鉴定出丝织品残片。本发明反应温和、环保无害；在对古代丝织品进行检测时，具有样品用量少、直观、快速和高灵敏性的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江理工大学
发明人：	陈茹茹;王秉;杨慧;周莲;胡智文
专利状态：	有效
申请号：	CN201811579245.9
公开号：	CN109541219A
代理机构：	杭州永航联科专利代理有限公司 33304
代理人：	侯兰玉
分类号：	G01N33/577(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310018 浙江省杭州市江干区下沙高教西区2号大街928号
主权项：	1.一种古代丝织品的免疫印迹检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）蚕丝特异性抗体的制备：称取桑蚕丝，经脱胶、溶解、透析、纯化和冷冻干燥后，得到桑蚕丝丝素蛋白粉末；将桑蚕丝丝素蛋白粉末溶解在PBS中注射进SPF级Balb/C纯种雌性小鼠体内，经多次脾脏免疫后，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选、培养和纯化后，得到桑蚕丝丝素蛋白单克隆抗体；2）Fab片段抗体的制备：先在分离柱中对固定化木瓜蛋白酶进行活化，同时将步骤1）中所得抗体在buffer交换柱中进行前处理，得到抗体溶液；将抗体溶液加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中，拧紧柱子盖子，置于35‑39℃恒温震荡孵化箱中酶解反应，采用亲和层析法纯化和凝胶过滤层析柱对酶解产物进行分离纯化后，得到桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体；3）Fab‑BM‑Au NP复合物的制备：将步骤2）所得桑蚕丝丝素蛋白Fab片段抗体进行硫醇化处理后，分别取50‑80 μL加入到Au NP溶液中，于35‑39℃恒温震荡孵化箱中反应40‑50min，11000‑14000rpm 离心10‑20min后，重新分散在PBST中，得到Fab‑BM‑Au NP复合物；4）称取古代丝织品残片作为样品，以1:90‑110的浴比在0.4‑0.6wt%的Na2CO3溶液中煮沸20‑40min，重复两次完成脱胶，样品用去离子水小心清洗3‑5次，放入35‑39℃烘箱低温烘干；5）称取步骤4）中处理过的古代丝织品残片，浸入钙醇溶液中加热溶解，经透析、过滤和冷冻干燥后，得到丝素蛋白粉末，待用；6）取步骤5）所得丝素蛋白粉末，溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液中，得到8‑12mg/mL的蛋白溶液，将蛋白溶液与还原性上样缓冲液5X loading以3.5‑4.5:1的体积比混合，在96‑100℃加热8‑12min，进行蛋白变性处理，冷却至室温后，于6000‑10000rpm 离心3‑7min，取上清液作为电泳样品；7）电泳：将电泳样品和蛋白质Marker加入制备好的免染胶加样孔中，免染胶上层为浓缩胶，下层为分离胶；在恒压条件下进行电泳：80 V跑浓缩胶，8‑12min后120 V跑分离胶，直至样品跑至凝胶底部，停止电泳，将凝胶取出后，放入化学发光仪中观察凝胶图像；8）转印：裁剪一张尺寸大于凝胶的PVDF膜，一角做标记，用甲醇浸泡0.5‑1.5 min进行活化处理后，将膜与海绵片、滤纸一起放在转印缓冲液中浸泡20‑40 min，而后按照“海绵片—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵片”的顺序，搭建转印“三明治”，并将其放入转移装置中，倒入转印缓冲液后，在冰浴条件下200 ‑300 mA恒流转印1.5‑2 h，转印完成后，将膜取出，放入化学发光仪中观察转印情况；9）免疫：将转印完成的PVDF膜放在抗体孵育盒中，加入4‑6%的脱脂奶粉TBST溶液封闭0.5‑1.5 h，加入Fab‑BM‑Au NP复合物稀释溶液，在室温条件下摇床孵育0.5‑1.5 h；而后用TBST洗涤3次，每次5‑10 min，加入HRP标记的二抗稀释溶液，于室温条件下摇床孵育0.5‑1.5 h，重复洗涤步骤；10）显色：将免疫后的PVDF膜浸入ECL显色液中，避光4‑6 min，将PVDF膜放入化学发光仪中成像，观察免疫条带，若可观察到免疫条带，则表明古代丝织品残片为桑蚕丝。
所属类别：	发明专利