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原文传递一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用

专利名称：	一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用
摘要：	本发明提供了一种双抗夹心法胶体金检测的试剂盒，该试剂盒使用了特定成分的金标抗体封闭液、金标抗体稀释液、固定抗体稀释液。该试剂盒通过三种特定成分的试剂，使得原本胶体金检测中的金标抗体和固定抗体能够互换，当使用该三种试剂后，检测灵敏度与原有的胶体金检测结果相比增加或相当。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
发明人：	田克恭;王莹
专利状态：	有效
申请日期：	2018-03-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-11T00:00:00+0800
申请号：	CN201810293313.9
公开号：	CN110320364A
代理机构：	北京华夏正合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	韩登营
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	471003 河南省洛阳市自由贸易试验区洛阳片区高新区华夏路6号
主权项：	1.一种双抗夹心法胶体金检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括双抗夹心法胶体金测试纸条和样品处理液；所述双抗夹心法胶体金测试纸条上的金标抗体使用金标抗体封闭液处理，所述金标抗体封闭液包括磷酸盐缓冲液、大分子蛋白、Tween-20组成，所述磷酸盐缓冲液为pH7.4 0.1M PBS溶液，所述大分子蛋白为BSA、OVA、胎牛血清、脱脂奶中的任一种；所述金标抗体封闭液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2％～1.0％W/V BSA、0.02％～1.0％W/VTween-20；所述金标抗体使用金标抗体稀释液稀释，所述金标抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、PEG4000、Proclin300，或包括pH7.4 0.1M PBS溶液、PEG6000、Proclin300；所述金标抗体稀释液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/V PEG4000、0.02％V/V Proclin300，或pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％V/V PEG6000、0.02％V/V Proclin300；以及所述双抗夹心法胶体金测试纸条上的固定抗体使用固定抗体稀释液稀释，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、糖类稳定剂、Triton-X 100；优选地，所述糖类稳定剂为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇中的任一种；优选地，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1MPBS溶液、蔗糖、Triton-X 100；所述固定抗体稀释液进一步优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％V/V蔗糖、0.1％V/V Triton-X 100。 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条上包被有金标抗体，所述金标抗体标记的胶体金其胶体金溶液最大吸收峰为515～530nm、最大吸收峰对应的ODmax值为0.9～1.1、0.75×ODmax值对应的吸收峰峰间距为55～72nm。 3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述金标垫上吸附有金标抗体，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有固定抗体，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述金标抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移。 4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述金标抗体溶解于金标抗体稀释液中的浓度为10～250μg/ml，优选地，所述金标抗体溶解于金标抗体稀释液中的浓度为25～100μg/ml；所述固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经固定抗体稀释液稀释至0.5～3mg/ml、1～3mg/ml。 5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述检测线和质控线两线间距≥5mm。 6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述双抗为CCTCC No:C2014198小鼠杂交瘤细胞3G12分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12，和CCTCC No:C2014199小鼠杂交瘤细胞2F8分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8；或者所述双抗为猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2，和猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.1所示，轻链可变区为SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.3所示，轻链可变区为SEQ ID No.4所示；或者所述双抗为猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-3D2，和猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-4B4，所述单克隆抗体TGEV-3D2重链可变区为SEQ ID No.5所示，轻链可变区为SEQ ID No.6所示，所述单克隆抗体TGEV-4B4重链可变区为SEQ ID No.7所示，轻链可变区为SEQ ID No.8所示；或者所述双抗为抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB1，和抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB2，所述单克隆抗体IV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.9所示，轻链可变区为SEQ ID No.10所示，所述单克隆抗体IV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.11所示，轻链可变区为SEQ ID No.12所示；或者所述双抗为CCTCC No:C201578小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11，和CCTCC No:C201579小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4；或者所述双抗为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5，和CCTCC No：C2015202小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11；或者所述双抗为犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，和犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，所述单克隆抗体CAV-5G4重链可变区为SEQ.ID No.13所示，轻链可变区为SEQ.ID No.14所示，所述单克隆抗体CAV-1A1重链可变区为SEQ.ID No.15所示，轻链可变区为SEQ.ID No.16所示。 7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述样品处理液包括pH7.40.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷、Proclin300；所述样品处理液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％～1.0％W/VCHAPS、0.1％～1.0％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300；所述样品处理液进一步优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V CHAPS、0.5％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述样品处理液1ml溶解固体样品0.08～0.5g和/或所述样品处理液1ml溶解液体样品500～1500μl；所述样品选自组织、血清、肛门分泌物、粪便、咽鼻分泌物、眼鼻分泌物、病毒培养物。 9.一种制备权利要求1所述的双抗夹心法胶体金检测的试剂盒的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)用胶体金标记单克隆抗体为金标抗体，用所述金标抗体封闭液封闭所述金标抗体，再用所述金标抗体稀释液稀释所述金标抗体至10～250μg/ml，然后将所述金标抗体吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜即成金标垫，干燥后使用；步骤(2)固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经所述固定抗体稀释液稀释至0.5～3mg/ml、1～3mg/ml，分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线，所述检测线、质控线两线间距≥5mm，干燥所述硝酸纤维素膜；步骤(3)配制样品处理液，分装；以及步骤(4)将所述步骤(1)所制备的金标垫、所述步骤(2)制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴底板上，裁剪；连同所述步骤(3)制备的样品处理液组装成试剂盒。 10.一种样品处理液，所述样品处理液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷、Proclin300；所述样品处理液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％～1.0％W/V CHAPS、0.1％～1.0％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300；所述样品处理液进一步优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V CHAPS、0.5％W/V皂苷、0.02％V/V Proclin300。
所属类别：	发明专利