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原文传递一种双抗夹心法酶免疫层析检测试剂盒及制备方法与应用

专利名称：	一种双抗夹心法酶免疫层析检测试剂盒及制备方法与应用
摘要：	本发明涉及一种试剂盒包括酶免疫层析检测试纸条、样品处理液、缓冲液和缓冲液供应单元，缓冲液包含磷酸盐缓冲液、大分子蛋白、Tween‑20和防腐剂以及过氧化氢脲、过氧化氢尿素、双氧水中的任一种；酶免疫层析检测试纸条包括底物垫，其上吸附有经底物垫稀释液稀释后干燥而成的酶底物，底物垫稀释液包括无水乙醇、pH7.40.1M PBS溶液以及0.5％～4％W/V PEG6000或PEG4000；酶免疫层析检测试纸条包括酶标垫，其上吸附有经酶标抗体稀释液稀释后干燥而成酶标抗体，酶标抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、以及0.5％V/V PEG4000、PEG6000或PEG8000中的任一种；酶免疫层析检测试纸条包括检测线和质控线，检测线上固定有经固定抗体稀释液稀释的固定抗体，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％V/V海藻糖、0.1％V/V Tween‑20。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
发明人：	田克恭;王莹
专利状态：	有效
申请日期：	2018-04-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201810283311.1
公开号：	CN110346554A
代理机构：	北京华夏正合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	韩登营
分类号：	G01N33/535(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	471003 河南省洛阳市自由贸易试验区洛阳片区高新区华夏路6号
主权项：	1.一种双抗夹心法酶免疫层析检测试剂盒，所述试剂盒包括酶免疫层析检测试纸条、样品处理液、缓冲液和缓冲液供应单元，其特征在于，所述缓冲液包含磷酸盐缓冲液、大分子蛋白、Tween-20和防腐剂,以及过氧化氢脲、过氧化氢尿素、双氧水中的任一种；优选地所述磷酸盐缓冲液为pH7.4 0.1M PBS溶液；优选地所述大分子蛋白为BSA、OVA、胎牛血清中的一种或多种；优选地所述防腐剂为庆大霉素、硫酸卡那霉素、叠氮钠、硫柳汞及其盐类、Proclin300中的任一种；所述过氧化氢脲、过氧化氢尿素、双氧水的浓度为0.02％～0.2％W/V；优选地所述过氧化氢脲、过氧化氢尿素、双氧水的浓度为0.05％～0.1％W/V；进一步优选地包含pH7.4 0.1M PBS溶液、0.1％～0.5％V/VTween-20、0.02％V/V Proclin300、0.05％V/V过氧化氢脲、以及0.5％～1％W/V的任一种BSA、OVA和胎牛血清；所述酶免疫层析检测试纸条包括底物垫，其上吸附有经底物垫稀释液稀释后干燥而成的酶底物，所述底物垫稀释液包括无水乙醇、pH7.4 0.1M PBS溶液以及0.5％～4％W/VPEG6000或PEG4000；优选地，底物垫稀释液包括2％V/V无水乙醇、0.1％V/VPEG4000、pH7.4的0.1M PBS；所述酶免疫层析检测试纸条包括酶标垫，其上吸附有经酶标抗体稀释液稀释后干燥而成酶标抗体，所述酶标抗体稀释液包括pH7.40.1M PBS溶液、以及0.5％V/V PEG4000、PEG6000或PEG8000中的任一种；优选地，所述酶标抗体稀释液包括0.5％V/VPEG4000、pH7.4的0.1M PBS；所述酶免疫层析检测试纸条包括检测线和质控线，所述检测线上固定有经固定抗体稀释液稀释的固定抗体，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％V/V海藻糖、0.1％V/V Tween-20。 2.根据权利要求1所述的酶免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测试纸条、样品处理液、缓冲液和缓冲液供应单元，其中，所述检测试纸条从纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括所述底物垫，其上吸附有干燥的酶底物，优选地所述酶底物为四甲基联苯胺；所述样品供应区包括所述酶标垫，其上吸附有酶标抗体，所述酶优选为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶，所述酶底物能与所述酶标抗体上的酶产生显色反应；所述检测区包括所述检测线以及所述质控线，所述质控线上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；所述缓冲液供应单元用于将所述缓冲液供给至所述检测试纸条的底物供应区，并使得缓冲液和随缓冲液扩散的样品处理液、酶底物和酶标抗体沿检测试纸条的纵向而向远离底物供应区的一端迁移。 3.根据权利要求2所述的酶免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体溶解于所述酶标抗体稀释液中的浓度为0.5～10μg/ml、所述固定抗体溶解于所述固定抗体稀释液中的浓度为0.5～1mg/ml、羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗溶解于磷酸盐缓冲液或所述固定抗体稀释液中的浓度为1～3mg/ml、酶底物溶解于底物垫稀释液的终浓度为0.5％～4％W/V。 4.根据权利要求2所述的酶免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述检测线和所述质控线两线间距≥5mm。 5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，酶标抗体中的单克隆抗体和固定抗体中的单克隆抗体为CCTCC No:C2014198小鼠杂交瘤细胞3G12分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12和CCTCC No:C2014199小鼠杂交瘤细胞2F8分泌的猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8的任意组合；或者为猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB2和猪流行性腹泻病毒单克隆抗体PEDV-McAB1的任意组合，所述单克隆抗体PEDV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.1所示、轻链可变区为SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体PEDV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.3所示、轻链可变区为SEQ ID No.4所示；或者为猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-3D2和猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体TGEV-4B4的任意组合，所述单克隆抗体TGEV-3D2重链可变区为SEQ ID No.5所示、轻链可变区为SEQ ID No.6所示，所述单克隆抗体TGEV-4B4重链可变区为SEQ ID No.7所示、轻链可变区为SEQ ID No.8所示；或者为抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB1和抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体IV-McAB2的任意组合，所述单克隆抗体IV-McAB1重链可变区为SEQ ID No.9所示、轻链可变区为SEQ ID No.10所示，所述单克隆抗体IV-McAB2重链可变区为SEQ ID No.11所示、轻链可变区为SEQ ID No.12所示；或者为CCTCC No:C201578小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11和CCTCC No:C201579小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株分泌的犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4的任意组合；或者为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5和CCTCC No：C2015202小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌的犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11的任意组合；或者为犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4和犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1的任意组合，所述单克隆抗体CAV-5G4重链可变区为SEQ.ID No.13所示、轻链可变区为SEQ.ID No.14所示，所述单克隆抗体CAV-1A1重链可变区为SEQ.ID No.15所示、轻链可变区为SEQ.ID No.16所示。 6.根据权利要求1所述的酶免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液包含pH7.4 0.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷和防腐剂；优选地，所述样品处理液包含pH7.4 0.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷和Proclin300；更优选地，所述样品处理液包含pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％～2.0％W/V CHAPS、0.5％～2.0％W/V皂苷和0.02％V/V Proclin300；最优选地，所述样品处理液包含pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V CHAPS、1％W/V皂苷、0.02％V/VProclin300。 7.根据权利要求6所述的酶免疫层析检测试剂盒，其特征在于，固体样品溶解于所述样品处理液的溶解量为0.08～0.5g/500-1500μl，液体样品溶解于所述样品处理液的溶解量为500～1500μl/500-1500μl；经样品处理液溶解后的样品检测用量为50～150μl；所述样品选自组织、血清、肛门分泌物、粪便、咽鼻分泌物、眼鼻分泌物和病毒培养物。 8.一种用于权利要求1-7任一项所述试剂盒的样品处理液，其特征在于，所述样品处理液包含pH7.4 0.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷和防腐剂；优选地，所述样品处理液包含pH7.40.1M PBS溶液、CHAPS、皂苷和Proclin300；更优选地，所述样品处理液包含pH7.40.1M PBS溶液、0.5％～2.0％W/V CHAPS、0.5％～2.0％W/V皂苷和0.02％V/V Proclin300；最优选地，所述样品处理液包含pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V CHAPS、1％W/V皂苷、0.02％V/VProclin300。 9.根据权利要求8所述的样品处理液，其特征在于，所述样品处理液检测的样品选自组织、血清、肛门分泌物、粪便、咽鼻分泌物、眼鼻分泌物和病毒培养物。 10.一种制备权利要求1-8任一项所述试剂盒的方法，其特征在于，包括：步骤(1)配制缓冲液；步骤(2)使用底物垫稀释液将底物稀释，并将其吸附于吸附物即得底物垫，干燥后置于检测试纸条中；步骤(3)标记单克隆抗体为酶标抗体，用酶标抗体稀释液将其稀释，并吸附于吸附物即得酶标垫，干燥后置于检测试纸条中；步骤(4)固定抗体经固化抗体稀释液稀释并作为检测线固定于检测试纸条中，羊抗鼠多抗或羊抗鼠单抗固定于质控线，干燥；步骤(5)配制样品处理液；以及步骤(6)将所述酶免疫层析检测试纸条、所述样品处理液、所述缓冲液和缓冲液供应单元装配成试剂盒。
所属类别：	发明专利