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原文传递 CMPF均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法

专利名称：	CMPF均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法
摘要：	本发明公开了一种CMPF均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法，试剂盒的CMPF抗体的免疫原由CMPF与蛋白质或多聚赖氨酸偶联物作为免疫原进行免疫获得。分别利用CMPF支链末端的‑COOH与蛋白质或多聚赖氨酸分子上的‑NH2进行偶联；接着利用这些偶联物免疫物作为免疫原进行免疫小鼠或家兔，最后获得特异性的抗CMPF的单克隆或多克隆抗体；并基于该抗CMPF的单克隆或多克隆抗体建立CMPF含量检测方法；该检测方法可在生化分析仪等大型自动化仪器上进行大样本自动化检测分析。检测方法具有检测灵敏度高，特异性强，检测重复性高和稳定性好等优点，本发明方法检测灵敏度0.5μg/L。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州博谱医药科技有限公司
发明人：	朱永良;王轶雄;程小龙
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201811518946.1
公开号：	CN109765360A
代理机构：	北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	陈剑聪
分类号：	G01N33/535(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311100 浙江省杭州市余杭区仓前街道龙潭路8号1幢105室
主权项：	1.一种CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：试剂R1,其含有CMPF抗体、NAD辅酶和G-6-P-Na2；试剂R2，其含有G6PDH-CMPF偶联物和载体；标准品溶液，其由CMPF与校准品稀释液梯度稀释而成，所述校准品稀释液含有缓冲液和载体。 2.根据权利要求1所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述CMPF抗体为抗CMPF的特异性鼠源性单克隆IgG型抗体或抗CMPF的兔源性多克隆IgG抗体，所述特异性鼠源性单克隆IgG型抗体包括IgG1和/或IgG2a和/或IgG2b和/或IgG3和/或IgG4型抗体；所述兔源性多克隆IgG抗体包含F(ab')2特异性抗体片段。 3.根据权利要求2所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述载体为载体蛋白质和/或多聚赖氨酸，所述载体蛋白质为BSA、OVA、KLH中的一种或多种。 4.根据权利要求3所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。 5.根据权利要求4所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1由如下组分和含量组成：所述试剂R2由如下组分和含量组成：所述标准品稀释液由如下组分和含量组成：磷酸盐缓冲液 0.05-0.2M， BSA 0.01-10g/L，稳定剂 0.1-0.5g/L。 6.根据权利要求5所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述所述表面活性剂为Triton X-100、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一种或多种，所述稳定剂为甘露醇、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000中的一种或多种。 7.一种权利要求6所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其中G6PDH-CMPF偶联物的制备，包括如下步骤：将CMPF与G6PDH混合，并加入碳二亚胺，在碳二亚胺作用下，CMPF的羧基与G6PDH的氨基结合进行偶联反应，将反应液上柱，然后分离纯化得到G6PDH-CMPF偶联物。 8.一种权利要求7所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其中抗CMPF的特异性鼠源性单克隆IgG型抗体的制备，包括如下步骤： S1.CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物的制备将CMPF与载体蛋白质混合，并加入碳二亚胺，在碳二亚胺作用下，CMPF与载体蛋白质进行偶联反应，然后透析得到CMPF-蛋白质偶联物；或者载体蛋白质用多聚赖氨酸代替，得到CMPF-多聚赖氨酸偶联物； S2.动物免疫以CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物/次/只小鼠的浓度与等量的完全福氏佐剂混匀，皮下多点注射免疫Balb/c雌性小鼠，第1次与第2次间隔10-14天，以后每次间隔7天，连续5次，第2-5次CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物与等量的不完全福氏佐剂乳化混匀，间隔1周后采用尾静脉/腹腔注射无菌的CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物，以加强免疫1次，3天后细胞融合； S3.杂交瘤细胞的制备取步骤S2免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按体积比1:6在50％PEG的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶选择培养基中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，2周后换为次黄嘌呤-胸腺嘧啶培养基，继续在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养；待克隆孔长至1/3-1时，取培养上清液进行抗体检测筛选； S4.特异性克隆孔筛选用50mM的碳酸盐缓冲液稀释CMPF-蛋白质偶联物至100L/孔包被反应微孔4℃过夜或37℃120min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，用10％小牛血清室温封闭30min，再加入100μl上述步骤2.2培养上清液室温反应60min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，最后再加入1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP室温反应60min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，加入四甲基联苯氨底物显色观察；凡出现明显蓝色反应者为阳性，否则为阴性；保留与CMPF-蛋白质偶联物有反应的细胞克隆孔，再采用有限稀释法进行3次克隆筛选，建株的杂交瘤细胞再扩大培养、冻存，用于制备腹水； S5.腹水的制备和纯化将稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后，以0.5×104-5×105个/只接种到预先用0.5mL降植烷或液体石蜡致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔，7-12天内观察，收取腹水，离心后测定效价；经50％饱和硫酸铵沉淀保存或者低温冻存；腹水采用50％饱和硫酸铵沉淀-正辛酸沉淀，或者用50％饱和硫酸铵沉淀-rProtein A-Sepharose Fast Flow亲和层析纯化，最后用SDS-PAGE检测纯度，需达到90％，获得抗CMPF-蛋白质偶联物特异性单克隆抗体。 9.一种权利要求7所述的CMPF均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其中抗CMPF的兔源性多克隆IgG抗体的制备，包括如下步骤： S1.CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物的制备将CMPF与载体蛋白质混合，并加入碳二亚胺，在碳二亚胺作用下，CMPF与载体蛋白质进行偶联反应，然后透析得到CMPF-蛋白质偶联物；或者载体蛋白质用多聚赖氨酸代替，得到CMPF-多聚赖氨酸偶联物； S2.动物免疫以10mg CMPF-蛋白质偶联物/次/只与等量完全福氏佐剂混匀，家兔皮下多点注射免疫，每1-2周1次，连续5次，间隔1周后采用分离颈动脉，收集血液约80-120毫升，室温放置2小时，4℃10000rpm离心30min，分离收集血清；上述血清再用CMPF-蛋白质偶联物，亲和层析柱纯化抗CMPF的特异性IgG型抗体，最后用8％SDS-PAGE检测纯度，需达到90％；获得兔源性多克隆IgG抗体；上述纯化的兔源性多克隆IgG抗体进一步在pH 4.5的50mM醋酸盐缓冲液中用0.1％(质量比)的胃蛋白酶切除IgG的Fc'端，37℃反应12小时，然后在调或不调pH值的情况下，用饱和硫酸铵和/或SPA和/或CMPF-蛋白质偶联物亲和层析方法纯化F(ab')2抗体片段；获得特异性的抗CMPF的F(ab')2特异性抗体片段。 10.一种CMPF含量的检测方法，其特征在于，采用权利要求8或9的制备方法制备得到的CMPF均相酶免疫检测试剂盒进行CMPF含量的检测，包括如下步骤： S1.标准曲线的建立将试剂R1与标准品溶液混合，混合体积比例为10-200:1，恒温孵育1-10分钟，加入等体积的试剂R2，在自动生化分析仪或紫外分光光度计上，用340nm波长，测定光密度OD值或吸光度A值，以标准品浓度为横坐标，光密度OD值或吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线； S2.样品的测试将试剂R1与样品混合，样品体积与标准品溶液一致，恒温孵育1-10分钟，加入等体积的试剂R2，在自动生化分析仪或紫外分光光度计上，用340nm波长，测定光密度OD值或吸光度A值； S3.CMPF含量的测定记录样品加入后的OD值或吸光度A值，根据标准曲线读数，得到样品中CMPF的含量浓度。
所属类别：	发明专利