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原文传递一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒

专利名称：	一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒
摘要：	本发明提供了一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，核心检测组件为将时间分辨荧光微球与透明质酸(HA)抗体偶联制成的荧光探针和包被在检测卡NC膜上的HA‑BSA偶联物，检测时，NC膜检测区的荧光强度与样本中的HA含量成负相关，可准确定量的检测HA的含量。本发明具有操作简便和测量准确的优点，有利于快速准确的进行肝纤维化的早期诊察。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	天津;12
申请人：	博奥赛斯(天津)生物科技有限公司
发明人：	刘萍;栾大伟;刘朝阳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910614274.2
公开号：	CN110346563A
代理机构：	天津企兴智财知识产权代理有限公司
代理人：	陈雅洁
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	300300 天津市东丽区东丽开发区四纬路10号201
主权项：	1.一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其中检测卡包括吸水纸、NC膜、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴于PVC胶板的检测条和带有读数视窗的卡壳组成，其特征在于：反应部件包括荧光探针和包被在NC膜上的检测区和质控区；其中荧光探针为时间分辨荧光微球偶联HA抗体。 2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：所述荧光探针的制备包括如下步骤， 1)取0.01～0.05M pH为5.0-7.0的MES缓冲液置于离心管中； 2)向上述离心管中加入羧基修饰的时间分辨荧光微球，加入的荧光微球与缓冲液的体积比为1：5-1：20； 3)超声30s-1min进行重悬； 4)将上述分散均一的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物； 5)吸取0.01～0.05M pH为5.0-7.0的MES缓冲液加入到上述沉淀中，超声30s-1min进行重悬； 6)向分散均一的体系中加入10-20mg/mL的EDC和10-20mg/mL的NHS，室温混匀15-20min后，8000-12000g离心10-15min，弃上清，沉淀物用上述MES缓冲液复溶，置于2-8℃储存备用； 7)将一定量的HA抗体加入到步骤6)中所述的体系中进行偶联，使其终浓度为60-500μg/mL，室温旋转混匀2-4h； 8)向步骤7)中所述的偶联体系中加入质量体积比为8-10％的BSA，使其BSA的终浓度为1-2％，终止偶联，此过程需室温旋转混匀0.5-2h； 9)将步骤8)中所述的已终止偶联的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物； 10)用含蔗糖质量浓度为5-8％，海藻糖质量浓度为3-5％以及体积浓度为0.03-0.3％的Procline300的pH为5.0-7.0的0.01M MES缓冲液，将沉淀物重悬，得到用于检测HA的荧光探针浓储液；检测HA的荧光探针浓储液中HA的抗体浓度为60-500μg/mL。 3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：检测区包被有HA-BSA偶联物；质控区包被有亲和素或链霉亲和素(SA)；包被有SA和HA-BSA的NC膜，通过将包被液喷涂在NC膜的质控区和检测区获得；所述的包被液是将SA和HA-BSA分别用含有质量浓度为0.5％-2％蔗糖、质量浓度0.1％-1％海藻糖、体积浓度0.03％-0.3％procline 300 0.01M的PBS(pH7.0-8.0)的缓冲液配制成终浓度0.5-2.5mg/mL的溶液，优选的配制成终浓度0.6-1mg/mL的溶液；含SA的包被液喷涂在质控区、含HA-BSA的包被液喷涂在检测区，喷涂量控制在0.5-1.5μL/cm，优选的0.75-1μL/cm。 4.根据权利要求1或2所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：时间分辨荧光微球内部包裹有镧系稀土元素；优选的，Eu(铕)和Tb(铽)；且时间分辨荧光微球的粒径为100-300nm，优选的，200nm。 5.根据权利要求1或3所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：所述检测区包被的HA-BSA偶联物，其制备包括如下步骤， 1)用0.01-0.05M pH为7.0-8.0的PBS缓冲液，将碳二亚胺(EDC)配制成终浓度为10-20mg/mL的EDC溶液； 2)称取一定量HA，将其置于0.1-0.6M的NaOH溶液中，配制成终浓度为5-10mg/mL的HA溶液； 3)用0.01-0.05M pH为7.0-8.0的PBS缓冲液，将BSA配制成终浓度为8-10mg/mL的BSA溶液； 4)将步骤1)中所述的EDC溶液与步骤2)中所述的HA溶液按体积比为1：1-1：5进行室温避光混合15-20min； 5)将步骤3)中所述的BSA溶液与步骤4)中所述的混合液按体积比为1：1-1：5混匀，室温避光混匀2-4h； 6)将上述偶联后的混合液进行透析，透析时间为18-24h，即可得到HA-BSA的偶联物。 6.根据权利要求1或3所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：所述的质控区和检测区的制备包括如下步骤， 1)用含有质量浓度为0.5％-2％蔗糖、质量浓度0.1％-1％海藻糖、体积浓度0.03％-0.3％procline 300 0.01M的PBS(pH7.0-8.0)的缓冲液将SA配制成终浓度为0.5-2.5mg/mL的溶液；HA-BSA配制成终浓度0.5-2.5mg/mL的溶液；优选的，用0.01M含质量分数为0.5-0.8％蔗糖和0.2-0.5％海藻糖、0.03-0.1％procline300的PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH为pH7.0-8.0，将SA和HA-BSA分别配制成终浓度为0.6-1.5mg/mL和0.6-1.5mg/mL的包被液； 2)通过喷金划线机将配制好的包被液分别喷涂在NC膜对应质控区和检测区的位置，喷涂量控制在0.5-1.5μL/cm，优选的0.75-1μL/cm。 7.根据权利要求1或2所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：所述荧光探针以稀释液或喷涂于结合垫的形式存在；当保存于样本稀释液中时，样本稀释液为0.01-0.05M且pH为7.0-8.0的PBS缓冲液，其中应至少包含质量浓度为0.5-0.8％的BSA、质量浓度为0.3-0.8％的蔗糖、质量浓度为0.2-0.5％的海藻糖、体积浓度为0.03-0.05％的Procline、体积浓度为0.03-0.05％的tween-20，将荧光探针的浓储液与该稀释液按1：50-1：350稀释，置于2-8℃保存，与检测卡搭配使用；当喷涂于结合垫时，将荧光探针的浓储液与稀释液按1：1-1：20进行稀释，混匀后按2-4μL/cm2进行喷涂于结合垫上，固化后结合垫、滤血膜和样品垫依次搭接的粘贴于包被板上，裁切成4-6mm宽的小条，组装进卡。 8.根据权利要求7所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：结合垫为玻纤膜、聚酯膜中的一种；在喷涂荧光探针前，进行以下处理， 1)蔗糖质量浓度为0.5-3％，海藻糖质量浓度0.5-3％，甘露醇质量浓度为0.5-2％，BSA质量浓度为0.05-2％，PEG6000质量浓度为0.05-0.5％，PEG20000质量浓度为0.05-0.5％，TX-100体积浓度为0.03-0.1％，procline300体积浓度为0.03-0.1％，用0.01-0.05M且pH为7.0-8.0的PBS缓冲液配制含以上成份或其中的几种成份的结合垫处理液； 2)取上述结合垫处理液向玻纤膜或聚酯膜上均匀喷涂或浸泡，注液量为60-80μL/cm2，优选的70μL/cm2。 3)均匀喷涂的结合垫置于37-50℃恒温鼓风干燥箱中进行烘干处理，放置6-8h；取出备用。 9.根据权利要求7所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：样品垫为玻纤膜、聚酯膜中的一种；在粘贴前，进行以下处理， 1)配制样品垫处理液应包含质量浓度为1-3％的蔗糖，质量浓度为0.1-0.5％的BSA，质量浓度为0.1％-2％的PEG6000，体积浓度为0.1-0.3％的triton X-100； 2)按60-80μL/cm2的注液量将玻纤或聚酯膜浸泡入上述处理液中1-5min； 3)取出，置于37-50℃恒温鼓风干燥箱内进行烘干，6-8h。 10.根据权利要求1～9任一项所述的试剂盒在检测透明质酸试剂中的应用。
所属类别：	发明专利