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原文传递检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒

专利名称：	检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒
摘要：	本发明提供一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒，选择MRJP2(王浆主蛋白2)作为中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的目标蛋白，以原核表达纯化的方法得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2，制备纯化得到两者的特异性和同一性抗体，以双抗体夹心法开发中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度，通过肉眼观察显色情况，能够在45min内鉴定出中蜂蜂蜜中1％比例的意蜂蜂蜜掺入，满足方便快捷的检测要求，是中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的可靠工具。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	胡福良;张言政;郑火青;张翠平
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910550683.0
公开号：	CN110376384A
代理机构：	杭州求是专利事务所有限公司
代理人：	赵杭丽
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
主权项：	1.一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含以下成分：包被中蜂MRJP2和意蜂MRJP2共有抗体的酶标板、HRP标记的特异性中蜂MRJP2抗体、HRP标记的特异性意蜂MRJP2抗体、样品稀释液、清洗液、TMB显色剂A、TMB显色剂B、阳性对照。 2.根据权利要求1所述的一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒，其特征在于，以制备得到的中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性和特异性抗体为基础，以双抗体夹心法建立中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜检测的ELISA方法。 3.权利要求1所述的一种检测中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，通过以下步骤获得： (1)目标抗原的选择：选择MRJP2作为中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜抗体制备的目标蛋白； (2)MRJP2的制备：确定原核表达纯化方案，优化MRJP2蛋白原核表达条件，得到中蜂MRJP2和意蜂的MRJP2； (3)MRJP2多克隆抗体的制备纯化：制备中蜂MRJP2和意蜂MRJP2兔多克隆抗体，亲和纯化得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2的特异性和同一性抗体； (4)试剂盒的制备：采用双抗夹心法，以中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性抗体包被微孔板，以HRP标记抗中蜂MRJP2抗体和抗意蜂MRJP2抗体，用TMB底物系统显色。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，中蜂MRJP2和意蜂MRJP2原核表达纯化方案为去除信号肽后进行序列优化，中蜂MRJP2N端的1-25个氨基酸为信号肽，其序列如SEQ.No.1所示:MTKWLFMVACLGIACQGAIIRQNS，意蜂MRJP2N端的1-17个氨基酸为信号肽，其序列如SEQ.No.2所示:MTRWLFMVACLGIACQ，中蜂MRJP2去除1-25氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的中蜂MRJP2序列如SEQ.No.3所示，然后进行密码子优化，优化后的中蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.4所示，意蜂MRJP2去除1-17氨基酸，进行氨基酸序列优化，优化后的意蜂MRJP2序列如SEQ.No.5所示，然后进行密码子优化，优化后的意蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.6所示，利用C端HIS标签纯化蛋白，酶切位点选择Nde I和Xho I，表达载体选择pET-22b(+)，感受态细胞为大肠杆菌BL21；MRJP2蛋白原核表达条件范围为：温度15℃-37℃，时间4h-16h，IPTG终浓度为0.2mM-1.0mM；中蜂MRJP2原核表达最适诱导条件为15℃诱导16h，IPTG终浓度为0.2mM；意蜂MRJP2原核表达最适诱导条件为37℃诱导4h，IPTG终浓度为0.2mM。 5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述HRP标记的抗中蜂MRJP2抗体稀释倍数为1000-2000倍，HRP标记的抗意蜂MRJP2抗体稀释倍数为4000-8000倍。 6.权利要求1所述试剂盒在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的检测中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括中蜂蜂蜜与意蜂蜂蜜蜂种来源真实性的检测、意蜂蜂蜜掺假中蜂蜂蜜的检测，以及中、意蜂蜂蜜相关产品的检测。 8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：加样、洗板、加入HRP标记的中蜂MRJP2抗体和HRP标记的意蜂MRJP2抗体、洗板、显色。 9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，对蜂蜜样品进行直接检测，或对蜂蜜蛋白提取物进行检测时，蜂蜜样品稀释倍数为5-200倍，对蜂蜜蛋白提取物进行检测时，蜂蜜水溶性蛋白浓度检测范围为0.01μg/mL-10mg/mL，室温或37℃，蜂蜜样品反应时间和HRP标记抗体反应时间在15-30min。 10.根据权利要求书8所述的应用，其特征在于，通过肉眼观察待测样品显色情况，根据显色为蓝色的微孔所加的酶标抗体对应的蜂种信息，判断此蜂蜜样品是中蜂蜂蜜还是意蜂蜂蜜，如果两孔都为蓝色，则该蜂蜜样品为掺有意蜂蜂蜜的中蜂蜂蜜。
所属类别：	发明专利