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原文传递一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用

专利名称：	一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用
摘要：	本发明提供了一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法及其应用。该方法首先在二氧化硅磁性微球的表面进行化学反应修饰镍离子螯合基团，再与含组氨酸标签的重组过敏原蛋白通过His/Ni‑NTA相互作用牢固结合。然后，依次孵育含有sIgE的病人血清和辣根过氧化物酶标记的第二抗体anti‑IgE；最后，利用化学发光技术读取信号，从而实现对病人血清中sIgE的特异性检测。与现有技术相比，本体系制备过程简单、成本低、效率高，且检测过程可在30 min内完成。从结果可以看出，本发明应用灵敏高、分离简便，能够实现对过敏反应的快速、灵敏且高通量、低成本、特异性好的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京工业大学
发明人：	余昌敏;韩希思;李林;曹梦妲;魏继福;吴琼;张承武;刘金华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910557872.0
公开号：	CN110346561A
代理机构：	南京先科专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	叶帅东
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	210000 江苏省南京市浦口区浦珠南路30号南京工业大学江浦校区
主权项：	1.一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，取3-12 mg二氧化硅磁性微球，超声分散在1.5-6 mL的pH为6的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中，以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清液，并清洗沉淀，重复离心洗涤操作2-4次后，将沉淀超声分散在1.5-6 mL的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液中得混合液A，备用；步骤2，将3-12 mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-16 mg的N-羟基琥珀酰亚胺依次加入1.5-6 mL的混合液A中，37℃下在摇床上活化0.5-2 h后以13500 rpm的转速离心10-30min，弃上清液，依次用2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液和磷酸盐缓冲液洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6 mL，以13500 rpm的转速离心10-30 min，弃上清，得活化后的二氧化硅磁性微球；步骤3，将2-8 mg的次氮基三乙酸溶解于1.5-6 mL的磷酸盐缓冲液中，将其加入活化后的二氧化硅磁性微球中，37℃下在摇床上摇6-24 h，依次用乙醇和磷酸盐缓冲液冲洗，循环冲洗操作2-4次，每次1.5-6 mL，以13500rpm的转速离心10-30min，弃上清，再将NTA功能化的磁性微球分散在去离子水中4℃保存；步骤4,向制备得到的NTA功能化的磁性微球中加入5-20 mL的0.05-0.2 M的氯化镍中，室温下在摇床上摇1-3 h，用去离子水洗3次，每次1.5-6 mL，13500 rpm下离心弃上清，重分散在去离子水中即得快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球。 2.根据权利要求1所述的一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤3中NTA的制备方法，包括以下步骤：第一步，0℃下，将0.5-1g N-碳苄氧基赖氨酸溶于4-8 mL的2 M氢氧化钠后，转入烧瓶中，将1.05-2.1 g的溴乙酸溶于10-20 mL的2M氢氧化钠中，并以0.5 mL/min的速度缓慢滴加到烧瓶中，室温下搅拌1.5-3 h，加热至50℃，反应15-20 h后，置于0℃下，再加入浓盐酸反应形成沉淀，减压过滤得白色粉末b；第二步，将0.5-1 g白色粉末b溶解于25-50 mL甲醇中，再加入50-100 mg质量分数为10%的钯碳，向反应器中充满氢气，在室温下搅拌10-16 h，再在减压条件下过滤除去钯碳得NTA。 3.根据权利要求2所述的一种快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球的制备方法，其特征在于，第一步中N-碳苄氧基赖氨酸与溴乙酸的摩尔比为1:2.1-8.2。 4.基于权利要求1制备方法所得的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球在制备临床检测过敏反应产品中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤a，将制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球滴加至96孔板中，再滴加含组氨酸标签的重组过敏原蛋白，室温孵育，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，去除未结合物，得混合物B；步骤b，向混合物B中加入待测血清样本，室温孵育，再用pH为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗未结合物；步骤c，再加入HRP-羊抗人sIgE，再室温下孵育后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗，再加入曝光液使其化学发光，实现对血清样本的sIgE的检测。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤a和步骤b中磷酸盐缓冲液的浓度是0.01 mol/L，清洗2-4次，每次10-40μL。 7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤a中制备得到的快速检测过敏反应的二氧化硅磁性微球与重组过敏原蛋白的体积比为1:5-20，室温下孵育5-30min。 8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤b中混合物B与待测血清样本的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30 min。 9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤c中待测血清样本与HRP-羊抗人sIgE的体积比为1:0.5-10，室温下孵育5-30min。
所属类别：	发明专利