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原文传递确定腺相关病毒制剂的效价的方法

专利名称：	确定腺相关病毒制剂的效价的方法
摘要：	本文提供了测量基因治疗载体制剂的定性属性和/或数量属性的方法。在某些实施方式中，基因治疗载体制剂是腺相关病毒(AAV)制剂(例如AAV8)。在某些实施方式中，该方法包括使用ELISA或ELISA结合低温透射电子显微镜(CryoTEM)确定AAV制剂的效价或剂量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	美国;US
申请人：	百深公司
发明人：	M·本迪克;R·尼西纳;E·伯姆;M·格兰因戈尔;C·菲德勒
专利状态：	有效
申请日期：	2018-03-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201880015509.X
公开号：	CN110352353A
代理机构：	上海华诚知识产权代理有限公司
代理人：	汤国华
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	美国伊利诺伊州
主权项：	1.一种量化AAV制剂剂量的方法，其中，所述方法包括：通过AAV特异性ELISA法定量AAV制剂中AAV衣壳的总数。 2.一种量化AAV制剂剂量的方法，其中，所述方法包括：通过AAV特异性ELISA法定量AAV制剂中AAV衣壳的总数，并通过低温透射电子显微镜CryoTEM评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。 3.一种测量AAV制剂中完整AAV衣壳浓度的方法，其中，所述方法包括：通过AAV特异性ELISA法定量AAV制剂中AAV衣壳的总数，并通过低温透射电子显微镜CryoTEM评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比。 4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法、直接ELISA法、间接ELISA法或竞争性ELISA法。 5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法。 6.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。 7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，评估步骤在ELISA法之前或之后进行。 8.如权利要求6或7所述的方法，其中，评估步骤包括：通过低温透射电子显微镜CryoTEM、负染色TEM、毛细管电泳、分析超速离心、天然琼脂糖凝胶、碱性琼脂糖凝胶、Southern杂交、斑点杂交、紫外分光光度法、弱阴离子交换色谱或质谱，测定完整AAV衣壳：空AAV衣壳的百分比或比率。 9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其中，评估步骤包括使用CryoTEM。 10.如权利要求8或9所述的方法，其中，CryoTEM步骤包括： (i)将AAV制剂嵌入惰性载体的基质中； (ii)快速冷冻嵌入的AAV制剂； (iii)使用低温透射电子显微镜对嵌入的AAV制剂成像； (iv)定量AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比。 11.如权利要求10所述的方法，其中，基质是无定形的非晶冰。 12.如权利要求10所述的方法，其中，AAV制剂不含细胞碎片。 13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括定量PCR。 14.一种给有需要的受试者施用AAV制剂的方法，其中，所述方法包括： (i)获得纯化的AAV制剂； (ii)使用AAV特异性ELISA法测量纯化的AAV制剂中AAV衣壳的浓度； (iii)给受试者施用治疗有效量的纯化的AAV制剂。 15.如权利要求14所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法、直接ELISA法、间接ELISA法或竞争性ELISA法。 16.如权利要求14或15所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法。 17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。 18.如权利要求17所述的方法，其中，评估步骤在ELISA法之前或之后进行。 19.如权利要求17或18所述的方法，其中，评估步骤包括：通过CryoTEM、分析超速离心、天然琼脂糖凝胶、碱性琼脂糖凝胶、Southern杂交、斑点杂交、UV分光光度法、弱阴离子交换色谱或质谱，确定完整AAV衣壳：空AAV衣壳的百分比或比率。 20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，评估步骤包括使用CryoTEM。 21.如权利要求14至20中任一项所述的方法，其中，所述纯化的AAV制剂的浓度为约1×1010cp/ml至约1×1020cp/ml。 22.如权利要求14至21中任一项所述的方法，其中，AAV制剂的治疗有效量为约1×1010cp/kg至约1×1016cp/kg的剂量。 23.如权利要求14至22中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括定量PCR。 24.如权利要求14至23中任一项所述的方法，其中，受试者是人。 25.一种给有需要的受试者施用特定剂量的AAV制剂的方法，其中，所述方法包括： (i)获得纯化的AAV制剂； (ii)使用AAV特异性ELISA法测量纯化的AAV制剂中AAV衣壳的浓度； (iii)给受试者施用特定剂量的纯化的AAV制剂。 26.如权利要求25所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法、直接ELISA法、间接ELISA法或竞争性ELISA法。 27.如权利要求25或26所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法。 28.如权利要求25或27所述的方法，其中，所述方法还包括：评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。 29.如权利要求28所述的方法，其中，评估步骤在ELISA法之前或之后进行。 30.如权利要求28或29所述的方法，其中，评估步骤包括：通过CryoTEM、分析超速离心、天然琼脂糖凝胶、碱性琼脂糖凝胶、Southern杂交、斑点杂交、UV分光光度法、弱阴离子交换色谱或质谱，确定完整AAV衣壳：空AAV衣壳的百分比或比率。 31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中，评估步骤包括使用CryoTEM。 32.如权利要求25至31中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括定量PCR。 33.如权利要求25至32中任一项所述的方法，其中，所述纯化的AAV制剂的浓度为约1×1010cp/ml至约1×1020cp/ml。 34.如权利要求25至33中任一项所述的方法，其中，AAV制剂的治疗有效量是约1×1010cp/kg至约1×1016cp/kg的剂量。 35.如权利要求25至34中任一项所述的方法，其中，受试者是人。 36.一种制备AAV制剂的方法，其中，所述方法包括： (i)用至少一种包含目的基因的质粒转染宿主细胞； (ii)收集包含AAV衣壳的细胞培养物的上清液或细胞悬浮液，制备AAV级分； (iii)使用AAV特异性ELISA法定量AAV级分中AAV衣壳的总数； (iv)基于AAV衣壳总数制备具有所需浓度的AAV制剂。 37.如权利要求36所述的方法，其中，所述方法还包括浓缩AAV级分。 38.如权利要求36或37所述的方法，其中，所述方法还包括从AAV级分中除去至少一部分空衣壳。 39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法、直接ELISA法、间接ELISA法或竞争性ELISA法。 40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中，ELISA法是对AAV抗原具有特异性的夹心ELISA法。 41.如权利要求36至40中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：评估AAV制剂中完整AAV衣壳相对空AAV衣壳的百分比或比率，即完整：空。 42.如权利要求41所述的方法，其中，评估步骤在ELISA法之前或之后进行。 43.如权利要求41或42所述的方法，其中，评估步骤包括：通过CryoTEM、分析超速离心、天然琼脂糖凝胶、碱性琼脂糖凝胶、Southern杂交、斑点杂交、UV分光光度法、弱阴离子交换色谱或质谱，确定完整AAV衣壳：空AAV衣壳的百分比或比率。 44.如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中，评估步骤包括使用CryoTEM。 45.如权利要求36至44中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括定量PCR。 46.如权利要求36至45中任一项所述的方法，其中，完整AAV衣壳的百分比为约40％至约100％。 47.如权利要求36至46中任一项所述的方法，其中，至少60％的AAV衣壳是完整AAV衣壳。 48.如权利要求36至47中任一项所述的方法，其中，浓度为约1×1010cp/ml至约1×1020cp/ml。 49.如权利要求36至48中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括冻干AAV制剂。 50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述AAV是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或嵌合AAV载体。 51.如权利要求50所述的方法，其中，AAV是AAV8。 52.如权利要求50所述的方法，其中，AAV是AAV9。 53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，AAV是基因工程AAV、化学修饰的AAV或两者。 54.如权利要求4至13、15至24、26至35和39至53中任一项所述的方法，其中，AAV抗原来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、嵌合AAV、基因工程AAV或化学修饰的AAV。 55.一种AAV制剂，其中，所述AAV制剂由权利要求36至54中任一项所述的方法制备。 56.如权利要求55所述的AAV制剂，其中，AAV制剂具有特异性效价，所述效价使用体外系统、体内系统或两者的组合验证。
所属类别：	发明专利