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原文传递一种基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法

专利名称：	一种基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法
摘要：	本发明属于检测方法领域，具体的涉及一种基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法。本发明的检测方法包括如下步骤：取待测单胚胎分泌蛋白的捕获抗体和标记抗体，将捕获抗体连接在免疫磁珠上，标记抗体用生物素标记；然后将免疫磁珠与待测单胚胎分泌蛋白混合并孵育，接着清洗后与标记抗体及链霉亲和素标记的β‑半乳糖苷酶混合并孵育，用PBS缓冲液重悬免疫磁珠，最后通过激光诱导荧光检测器检测荧光强度，得到待测单胚胎分泌蛋白的含量。本发明利用酶促反应不断催化底物反应生成荧光物质，可实现待测蛋白的信号放大；同时微流控液滴技术的引入，可快速富集荧光物质达到可测浓度，具有更高的检测灵敏度，检测所需要的的样品体积更小。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	深圳中山泌尿外科医院
发明人：	陈培林;李观贵;孙青;熊风;钟惠娴;姚志鸿
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-31T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-22T00:00:00+0800
申请号：	CN201910702915.X
公开号：	CN110361370A
代理机构：	北京轻创知识产权代理有限公司
代理人：	王博
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	518000 广东省深圳市福田区福强路1001号
主权项：	1.一种基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤： a、取待测单胚胎分泌蛋白的捕获抗体和标记抗体，将捕获抗体连接在免疫磁珠上，将标记抗体用生物素标记； b、将步骤a中的免疫磁珠与待测单胚胎分泌蛋白混合并孵育，接着将免疫磁珠取出清洗3～5遍，将清洗后的免疫磁珠、步骤a得到的用生物素标记的标记抗体及链霉亲和素标记的β-半乳糖苷酶混合后，孵育，然后将免疫磁珠取出清洗3～5遍，再用PBS缓冲液重悬免疫磁珠； c、将步骤b得到的重旋后的磁珠置于微流控液滴的第一样品孔中，将荧光底物置于第二样品孔中，将液滴生成油置于油相进样孔中，通过注射器将荧光底物和液滴生成油加入到第一样品孔中形成油包水液滴，将生成的油包水液滴用毛细管进行收集，收集完成后将毛细管两端封闭，进行孵育； d、将步骤c中得到的孵育完成的毛细管中的油包水液滴导入检测芯片，在鞘流的作用下，当油包水液滴经过检测窗口时，激光诱导荧光检测器检测得到油包水液滴的荧光强度，即得到待测单胚胎分泌蛋白的含量。 2.根据权利要求1所述的基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，在步骤a中，所述免疫磁珠的直径为5～10um，所述免疫磁珠的表面的功能基团为羧基或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种。 3.根据权利要求1所述的基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，在步骤b中，所述孵育的温度均为37℃，所述孵育的时间均为25～35min；所述清洗均采用纯水；所述PBS缓冲液的体积为5～20uL。 4.根据权利要求3所述的基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，所述孵育的时间均为30min；所述PBS缓冲液的体积为10uL。 5.根据权利要求1所述的基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，在步骤c中，所述荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷或试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷的一种。 6.根据权利要求5所述的基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，当荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述激光诱导荧光检测器的激发波长为473nm或488nm中的一种，荧光收集波段为510～530nm。 7.根据权利要求5所述的基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，当荧光底物为试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述激光诱导荧光检测器的激发波长为558nm，荧光收集波段为560～580nm。 8.根据权利要求1所述的基于微流控液滴的单胚胎分泌蛋白定量检测方法，其特征在于，在步骤c中，所述液滴生成油为氟油、矿物油和石蜡油中的任意一种，所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为1-3h。
所属类别：	发明专利