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原文传递一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法

专利名称：	一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法
摘要：	本发明公开了一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，包括以下步骤：S1，制备尿液exosome悬液；S2，测定尿液exosome悬液中蛋白浓度；S3，分选尿液exosome悬液中近端肾小管来源exosome；S4，对S3中分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测。本发明采用超速离心方法获得高纯度的尿液exosome，再采用免疫磁珠吸附exosome，克服了exosome体积小的问题，增加了流式细胞仪方法检测exosome的可行性；采用CD63和CD13免疫标记方法分选尿液中近端小管来源的exosome，并用于后续对尿液中近端肾小管来源exosome含量进行准确检测分析。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京医科大学第二附属医院
发明人：	杨俊伟;周阳;秦楠;徐玲玲;江蕾;曹红娣;熊明霞;闻萍
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-06T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910722404.4
公开号：	CN110412293A
代理机构：	西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	李振瑞
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	210003 江苏省南京市鼓楼区中山北路262号
主权项：	1.一种尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： S1，制备尿液exosome悬液 S2，测定尿液exosome悬液中蛋白浓度往S1的尿液exosome悬液中加入等体积的RIPA裂解液，混匀后得到exosome裂解液；测定exosome裂解液中蛋白浓度； S3，分选尿液exosome悬液中近端肾小管来源exosome 往CD63包被的磁珠中加入分选缓冲液，混匀后置于磁场环境中，弃上清，得到预处理磁珠；根据S2测得的尿液exosome悬液中蛋白浓度，取含有已知蛋白含量的尿液exosome悬液，加入预处理磁珠，并加入分选缓冲液，在2-8℃下混匀，然后再加入分选缓冲液，置于磁场环境中，弃上清，得到沉淀A，往沉淀A中加入分选缓冲液重悬，得到重悬液；往重悬液中加入PE标记的CD63抗体和APC标记的CD13抗体，孵育45-60min，再加入分选缓冲液，混匀后置于磁场环境中，弃上清，得到沉淀B，沉淀B用分选缓冲液清洗后弃上清，得到沉淀C；往沉淀C中加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，即得到尿液中近端肾小管来源的exosome； S4，检测尿液中近端肾小管来源exosome的含量采用流式细胞仪对S3中分选出的尿液中近端肾小管来源的exosome进行检测。 2.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，S1中制备尿液exosome悬液的方法如下： (1)将新鲜尿液在3000g下离心10min，收集上清A；往上清A中加入蛋白酶抑制剂混合物，混合均匀后于4℃、17000g离心10min，收集上清B；其中，新鲜尿液与蛋白酶抑制剂混合物的体积比为100:8.44； (2)上清B在20℃、200000g下离心1.5h，收集沉淀D，用蔗糖分离溶液重悬沉淀D，得到重悬液； (3)往重悬液中加入二硫苏糖醇，使二硫苏糖醇的浓度达到200mg/ml，然后95℃加热2min，再于25℃、200000g离心1.5h，收集沉淀E； (4)用蔗糖分离溶液重悬沉淀E，得到尿液exosome悬液；将尿液exosome悬液于-80℃保存备用。 3.根据权利要求2所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂混合物由叠氮钠、苯甲基磺酰氟、亮肽素按照100：10：1的摩尔比混合而成。 4.根据权利要求2所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述蔗糖分离溶液由三乙醇胺和蔗糖按照1：25的摩尔比混合而成。 5.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述RIPA裂解液中包括如下浓度各组分：50mM pH为7.4的磷酸盐缓冲液、质量浓度为1％的乙基苯基聚乙二醇40、质量浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠、100g/ml的苯甲基磺酰氟、质量浓度为0.5％的脱氧胆酸钠、1mM的钒酸钠、2g/ml的抑酞酶、2g/ml的抗蛋白酶以及2g/ml的亮肽素。 6.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，S2中采用采用BCA试剂盒测定exosome裂解液中蛋白浓度。 7.根据权利要求6所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，S2中测定尿液exosome悬液中蛋白浓度的方法如下： (1)制备标准曲线 BCA试剂盒的加样孔中分别加入不同浓度的蛋白标准品，然后在每个不同浓度蛋白标准品中加入A+B显色液，于56℃下孵育30min，再于570nm波长下读取OD值，然后以OD值为横坐标，蛋白浓度值为纵坐标作标准曲线，根据标准曲线拟合出线性回归方程； (2)尿液exosome悬液中蛋白浓度的检测 BCA试剂盒的加样孔中分别加入exosome裂解液和空白对照，然后在exosome裂解液和空白对照中分别加入A+B显色液，56℃孵育30min，在570nm波长下读取OD值，将OD值带入线性回归方程中计算exosome裂解液中蛋白浓度，即为尿液exosome悬液中蛋白浓度；其中，A+B显色液中A与B的体积比为50：1，且A中包括如下浓度各组分：质量浓度为1％的BCA二钠盐，质量浓度为2％的无水碳酸钠，质量浓度为0.16％的酒石酸钠，质量浓度为0.4％的氢氧化钠，质量浓度为的0.95％碳酸氢钠，A的pH为11.25； B为质量浓度4％的硫酸铜。 8.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述分选缓冲液为含质量浓度0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，且磷酸盐缓冲液的pH为7.4。 9.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，所述磁场环境由磁力架或磁铁提供。 10.根据权利要求1所述的尿液中近端肾小管来源exosome含量的检测方法，其特征在于，PE标记的CD63抗体和APC标记的CD13抗体的体积比为1：1。
所属类别：	发明专利