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原文传递一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒及其应用

专利名称：	一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开了一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒及其应用，一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，包括盒体，盒体内设有适配体亲和柱、时间分辨荧光微球冻干管和免疫层析试纸条。本发明采用时间分辨荧光微球进行抗体的标记，荧光半衰期长，产品稳定性较好，利于常温保存；检测限达到50ng/L，实现了毒品的精确检测；用适配体亲和柱将污水中待测药物甲基苯丙胺等小分子富集浓缩，提高了试纸条污水检测的灵敏度，按照浓缩10倍的效果，实际污水检测灵敏度可达到5ng/L；在批间差及试纸条的精密度方面有明显优势，而且反应充分，灵敏度更高；操作简便，本发明试纸条使用操作简便，不需要专业人员操作。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏苏博生物医学科技南京有限公司
发明人：	王宇峰;徐声乐;郑超;张明航;苏雪峰;赵晓芳;刘洋春;黄平
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910486826.6
公开号：	CN110426515A
代理机构：	南京苏创专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	杨勇
分类号：	G01N33/559(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	210033 江苏省南京市江北新区新锦湖路3-1号中丹生态生命科学产业园A座5楼
主权项：	1.一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，其特征在于：包括盒体，盒体内设有适配体亲和柱、时间分辨荧光微球冻干管和免疫层析试纸条。 2.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，其特征在于：适配体亲和柱用于将污水中待测药物小分子富集浓缩：利用SELEX技术筛选靶分子特异核酸适配体，偶联到琼脂或磁珠上，形成靶分子捕捉琼脂或磁珠，利用核酸配基与配体的分子识别原理，捕捉靶分子，结合靶分子捕捉琼脂或磁珠，从混合物中分离出；再通过加热、酸、碱或溶剂处理，使靶分子与靶分子捕捉琼脂或磁珠有效分离，从而得到纯化靶分子，达到污水中毒品浓缩富集的目的。 3.如权利要求2所述的时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，其特征在于：适配体亲和柱的制备方法包括如下步骤： (1)活化：将琼脂糖凝胶微球在去离子水中悬浮溶胀2±0.2小时成凝胶，洗涤、静置，移除清洗液，得溶胀的凝胶，其中，去离子水用量为每80mg琼脂糖凝胶微球3～4mL； (2)偶联：将生物素修饰的毒品适配体溶于Tris缓冲液中，再与链霉亲和素标记的磁珠混入步骤(1)中溶胀的凝胶中混合均匀，得悬浮凝胶液；其中，Tris缓冲液浓度为50.0mmol/L，pH8.0；毒品适配体与链霉亲和素标记的磁珠的摩尔比为(3±0.2):1； (3)装柱：将步骤(2)的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱，避免产生气泡，用0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液平衡小柱，即得适配体亲和柱。 4.如权利要求1-3任意一种所述的时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，其特征在于：时间分辨荧光微球冻干管中含有毒品单克隆抗体-时间分辨荧光微球复合物冻干粉。 5.如权利要求4所述的时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，其特征在于：时间分辨荧光微球冻干管的制备方法包括如下步骤： (1)将时间分辨荧光微球用MES缓冲液配成0.1±0.02wt％浓度，然后与EDC和NHS在30±2℃下混合0.5±0.1h；其中，EDC的浓度为1.0×10-4～2.4×10-4mol/L，NHS的浓度2.0×10-4～4.8×10-4mol/L； (2)将步骤(1)所得物料中加入待标记抗体，搅拌2±0.1h，待标记抗体加入量为50μg/mL； (3)将步骤(2)所得物料用封闭液封闭，搅拌30±2min，封闭液为10wt％牛血清白蛋白溶液； (4)将步骤(3)所得物料用离心机在4±1℃下离心，离心速度为12000±500r/min，离心时间为20±2min，然后去上清液； (5)用微球存储液将骤(4)所得沉淀物复溶，微球存储液为含有0.2±0.01％BSA、5±0.1％海藻糖及0.05±0.01％吐温20的Tris缓冲液； (6)在0.2M PBS缓冲液中依次加入海藻糖、BSA、Triton X-100和Proclin 300，得冻干液，其中，海藻糖浓度为5±0.01wt％，BSA浓度为0.5±0.01wt％，Triton X-100浓度为1±0.01wt％，Proclin 300浓度为0.1±0.01％wt％； (7)将步骤(5)所得物料装入冻存管中，加入步骤(6)制备的冻干液； (8)将冻存管置于冷冻干燥机中，冻存管中最终为淡黄色冻干粉，即得时间分辨荧光微球冻干管。 6.如权利要求5所述的时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，其特征在于：步骤(1)中，时间分辨荧光微球的发射波长为600-620nm。 7.如权利要求1-3任意一种所述的时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒，其特征在于：免疫层析试纸条包含PVC衬板、硝酸纤维膜、样品垫和吸收垫，样品垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次固定于PVC衬板之上，且硝酸纤维膜的两端分别与样品垫和吸收垫相交，硝酸纤维膜上设有检测线和质控线，检测线上包被有毒品-牛血清白蛋白偶联物，质控线上包被羊抗鼠IgG二抗。 8.权利要求1-7任意一项所述的时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒的应用，其特征在于：检测方法包括顺序相接的如下步骤： (1)将污水样品使用适配体亲和柱进行前处理得到待测样本液； (2)在时间分辨荧光微球冻干管中加入待测样本液充分混合均匀，反应2～5min，再取100ul反应液滴加到免疫层析试纸条中，反应5～8min，将免疫层析试纸条放入荧光层析检测仪检测窗口； (3)截留在检测线和质控线的荧光微球在激发光激发下，发出荧光，激发光的波长范围为300～400nm； (4)荧光层析检测仪检测检测线和质控线的荧光信号，并将荧光信号转化为电信号，然后通过标准曲线计算浓度，并呈现在荧光层析检测仪的显示屏上。 9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤(4)中标准曲线的制备：配制一系列从0开始的不同浓度x的添加毒品标准品的样本，进行步骤(1)中前处理后得到加标样品液，用同一批次的试纸条检测加标样品液，得到检测线与质控线荧光强度比值y，绘制毒品浓度与荧光强度比值关系的标准曲线logx＝a(y/y0)+b，其中y0代表浓度为0时的检测线与质控线荧光强度比值，a和b为系数。
所属类别：	发明专利