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原文传递一种用于超薄切片的植物组织整体染色法

专利名称：	一种用于超薄切片的植物组织整体染色法
摘要：	本发明公开一种用于超薄切片的植物组织整体染色法。该方法包括如下实验步骤：(1)固定：收集成熟的青杄花粉，用戊二醛与多聚甲醛进行前固定，再使用1％锇酸进行后固定；用TCH处理，再用1％锇酸进一步沉积锇；(2)块染：用2.5％醋酸钆、2.5％醋酸钐、2％醋酸双氧铀进行块染；(3)乙醇梯度脱水：分别用30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇进行脱水；(4)渗透：分别用乙醇与丙酮混合溶液、100％丙酮、丙酮与spurr树脂混合溶液、100％spurr树脂进行渗透处理；(5)包埋与聚合：在包埋板中加入100％spurr树脂，放入样品后置于烘箱进行聚合。本方法具操作简单、染色效果较好，图像对比度明显；还有利于超薄连续切片，为实现植物组织三维重构奠定了技术基础。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京林业大学
发明人：	李晓娟;姚小敏;林金星;马玲玉;沈微微
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910644850.8
公开号：	CN110455595A
分类号：	G01N1/28(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	100083北京市海淀区清华东路35号
主权项：	1.一种用于超薄切片的植物组织整体染色法，包括如下步骤： (1)固定植物材料；将成熟青杄花粉放置于由戊二醛与多聚甲醛配制的固定液进行前固定，PBS缓冲液清洗，再使用1％锇酸进行后固定； (2)利用TCH进行锇沉积；用1％TCH处理，常温放置30min-1h，再用1％锇酸浸渍，进一步沉积锇； (3)块染：分别用2.5％醋酸钆、2.5％醋酸钐、2％醋酸双氧铀对植物样品进行块染，4℃放置8-12小时或常温下放置4h； (4)脱水：对块染后的植物样品进行乙醇梯度脱水，分别用30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇进行梯度脱水； (5)渗透：分别用乙醇与丙酮混合溶液、100％丙酮、丙酮与spurr树脂混合溶液、100％spurr树脂进行渗透处理； (6)包埋与聚合：在包埋板中加入100％spurr树脂，放入植物样品，调整好位置，放于烘箱进行聚合。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中：所述PBS缓冲液的浓度为0.1M，pH为7.2；所述固定液为2.4％多聚甲醛与2％戊二醛的混合液；PBS缓冲液与固定液均需存放于4℃冰箱，使用时置于冰上；前固定后需用PBS缓冲液将前固定后的植物样品清洗3次，每次10-15min，充分洗去固定液；使用1％锇酸进行后固定，4℃环境下放置2h，之后必需用纯净水清洗3次，每次10-15min。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中：先称取0.05gTCH溶于5mL纯净水中，包一层锡纸避光，再将配制好的1％TCH放于60℃烘箱1h，每十分钟摇晃一次，最后用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用；加入300微升TCH，常温放置30min-1h，避免温度较低使TCH析出，用纯净水将TCH处理后的植物样品清洗3次，每次10-15min，再用1％锇酸进行锇沉积，室温下放置1h，之后用纯净水清洗3次，每次10-15min。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：2.5％醋酸钆、2.5％醋酸钐、2％醋酸双氧铀的块染剂均用纯净水配制，浓度为质量百分比。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中：分别用30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇进行梯度脱水，每次15min，100％乙醇脱水3次，目的是使样品充分脱水，其中30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇都为体积比浓度，溶剂是纯净水。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中：用乙醇与丙酮体积比为2:1、1:1、1:2的溶液处理，分别处理15min，之后用100％丙酮处理3次，每次15min，再用丙酮与spurr树脂体积比为2:1、1:1、1:2的溶液处理，分别处理3h，之后用100％spurr树脂处理至少3次，每12h换一次液体。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述spurr树脂配方为NSA硬化剂26g、ERL4221树脂10g、DER 736增塑剂6g、DMAE催化剂0.4g；步骤(6)中：聚合时先在40℃下聚合2h，之后在70℃下聚合8h。
所属类别：	发明专利