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原文传递一种组织完整、利于显微观察的植物组织切片的制备方法

专利名称：	一种组织完整、利于显微观察的植物组织切片的制备方法
摘要：	一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法，包括对新鲜鸭茅根部组织块的杀死与固定、采用的固定液为FAA混合固定液、即为福尔马林：冰醋酸：体积浓度70%乙醇=1:1:18、以体积比计，冲洗，脱水与透明，浸蜡与包埋，修块与切片，展片与烤片，脱蜡、复水与番红染色，固绿染色、脱水与透明，以及封片步骤；在冲洗步骤后、脱水与透明步骤前，还进行琼脂糖预包埋，所述琼脂糖预包埋是将冲洗后的鸭茅根部组织块包埋在经熬化后的5%琼脂糖凝胶中。本发明方法制得的鸭茅根部组织石蜡切片，其组织完整、细胞界限清晰、色彩鲜艳、颜色对比鲜明、切片干净。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	重庆;50
申请人：	西南大学
发明人：	曾兵;吴佳海;王少青;陈思怀;牟琼;张文;李娟
专利状态：	有效
申请日期：	2016-06-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910178749.8
公开号：	CN109855936A
代理机构：	重庆晶智汇知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	李靖
分类号：	G01N1/28(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	402460 重庆市荣昌县昌元街道学院路160号
主权项：	1.一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法，包括对新鲜鸭茅根部组织块的杀死与固定，冲洗，脱水与透明，浸蜡与包埋，修块与切片，展片与烤片，脱蜡、复水与番红染色，固绿染色、脱水与透明，以及封片步骤；其特征在于：在冲洗步骤后、脱水与透明步骤前，还进行琼脂糖预包埋，所述琼脂糖预包埋是将冲洗后的鸭茅根部组织块包埋在经熬化后的5%琼脂糖凝胶中、以质量百分含量计；所述杀死与固定步骤中，采用的固定液为FAA混合固定液，即为福尔马林：冰醋酸：体积浓度70 %乙醇=1:1:18、以体积比计；所述在杀死与固定后、冲洗前，还进行酸化，具体是将固定好的鸭茅根部组织块置于0.5 mol/L三氯乙酸溶液中，酸化6-7 d，在酸化过程中，3-4d时，更换一次0.5 mol/L三氯乙酸溶液；所述脱水与透明步骤是将经所述琼脂糖预包埋后的鸭茅根部组织块依次置于体积比为1:5:4的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为2:5:3的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为3:5:2的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为5:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比15:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于分析纯正丁醇中2 h，再置于分析纯正丁醇中2 h。 2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述浸蜡与包埋步骤中，将脱水与透明处理后的鸭茅根部组织块放于42℃的体积比为1:1的二甲苯和软蜡混合剂中，分Ⅰ、Ⅱ两级，各1小时；然后转移至53℃纯软蜡中浸蜡6小时，分Ⅰ、Ⅱ两级，各3小时；再转移至63℃纯硬蜡中浸蜡3小时，分Ⅰ、Ⅱ两级，各1.5小时；所述软蜡为熔点46-48℃的石蜡，所述硬蜡为熔点为56-58℃的石蜡。 3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述展片与烤片步骤中，在用于展片的载玻片上涂上蛋白甘油粘贴剂，所述蛋白甘油粘贴剂由体积比为1:1的鸡蛋清和甘油组成。 4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述脱蜡、复水与番红染色步骤中，采用二甲苯脱蜡三次，每次25分钟；所述复水依次进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中、乙醇均为体积百分浓度，每步停留4-5分钟，然后蒸馏水洗5秒后进入1%水溶液番红染液、质量浓度，密封过夜。 5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述固绿染色、脱水与透明步骤中，将经脱蜡、复水与番红染色处理的切片在95%乙醇中漂去浮色5-10秒，然后进入质量浓度为0.5%的95%乙醇固绿染液，保持30秒，所述95%乙醇为体积百分浓度；然后进行脱水：经三级分析纯无水乙醇处理，即为进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级，每级30秒-1分钟；脱水后进入透明处理：经三级分析纯二甲苯处理，即为进入二甲苯Ⅰ级、二甲苯Ⅱ级、二甲苯Ⅲ级，每级20分钟。 6.一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法，其特征在于，按如下步骤：（1）杀死与固定剪取新鲜鸭茅侧根部，用一次性双面刀片切取鸭茅根部组织块，约2~3 mm，后立即轻轻置于FAA混合固定液中固定、所述FAA混合固定液为体积比为1:1:18的福尔马林、冰醋酸、体积浓度70 %乙醇；固定液体积应为鸭茅根部组织块总体积的10~15倍；（2）酸化将固定好的鸭茅根部组织块置于0.5 mol/L三氯乙酸溶液中，酸化6-7 d，在酸化过程中，3-4 d时，更换一次0.5 mol/L三氯乙酸溶液；（3）冲洗剪取干净双层纱布折成方形，采用细小镊子将经酸化的鸭茅根部组织块置于纱布中央，用2 B铅笔做好材料名称及编号标记后，将纱布合拢，用尼龙绳将纱布绑好，以材料在流动的水中不漏出为准；将纱布小团置于流动的水中，冲洗24 h；（4）琼脂糖预包埋配制质量百分浓度为5 %的琼脂糖凝胶，经多次熬化后，倒入预先放置的4孔打孔器的平板上，厚度约5~7 mm，以备材料放入后进行封口；待琼脂糖冷凝后，取出打孔器，从流动的水中取出纱布团并打开纱布团，将冲洗完成后的鸭茅根部组织块横切面向上，依次用细小镊子轻放至凝胶孔底部，并将琼脂糖修整成规则的长条形，切去左上角以示材料编号，然后在酒精灯上进行琼脂孔的封口；（5）脱水与透明用镊子轻轻夹取包埋着的鸭茅根部组织琼脂块依次置于体积比为1:5:4的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为2:5:3的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为3:5:2的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为5:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比15:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于分析纯正丁醇中2 h，再置于新的分析纯正丁醇中2 h；（6）浸蜡与包埋在烘干的烧杯中倒入二甲苯，再倒入等量的液态软蜡制得体积比为1：1的二甲苯、软蜡混合剂，置于42℃恒温箱中备用；用细镊子夹取透明完全的鸭茅根部组织琼脂糖块轻放于42℃恒温箱中的二甲苯、软蜡混合剂，分I、II两级，各1 h；然后将琼脂糖块转移至纯软蜡在53℃恒温箱中浸蜡6 h，分I、II两级，各3 h；再转移至纯硬蜡在63℃恒温箱中浸蜡3 h，分I、II两级，各1.5 h；上述Ⅰ、Ⅱ两级是指重复两次，每次换上新的没使用过的相应蜡液；在备好的包埋纸盒中，倒入纯硬蜡II中的硬蜡，同时夹取浸蜡完成的琼脂糖块，摆正切面，待包埋纸盒中的硬蜡表面开始冷凝成固体，则立即将整个包埋纸盒置于冷水中，使其立刻凝固成蜡块；上述软蜡为熔点46~48℃的石蜡，硬蜡为熔点56~58℃的石蜡；（7）修块与切片剪开包埋纸盒，将石蜡块取出，用修块刀将石蜡块修成棱台形状，上、下切面平行，避开组织块，防止损伤组织块，然后固定在坚硬的小木方块上；用切片机夹夹紧木块，使蜡块与刀口平行，然后进行切片，切片厚度5~7μm；（8）展片与烤片经上述修块、切片后的蜡块成一连续条带状的蜡带，选取完整的蜡带分切成小段，先在洗净的载玻片上涂抹上一层由体积比为1:1的鸡蛋清和甘油组成的蛋白甘油粘贴剂、有效防止展片过程蜡带脱落，再用细小镊子轻轻地将蜡带放置于盛有蒸馏水的大烧杯内进行展片、预先将大烧杯放置于49~50℃恒温水浴锅内，保持大烧杯内水温与恒温水浴锅水温一致，用覆有所述蛋白甘油的载玻片进行捞片，用小镊子摆正蜡带位置、其位于载玻片下1/3~2/3处，用吸水纸吸去多余的水分，并用2B铅笔做好标记；然后将覆有蜡带的载玻片置于切片架上，于37℃恒温箱中烘片24 h；（9）脱蜡、复水与番红染色将上述干燥后的切片用二甲苯脱蜡三次，每次25分钟；脱蜡完毕后，即进入复水与番红染色系列：依次进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中、乙醇均为体积百分浓度，每步停留4-5分钟，然后蒸馏水洗5秒后进入1%水溶液番红染液、质量浓度，密封过夜；上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇；（10）固绿染色、脱水与透明将经脱蜡、复水与番红染色处理的切片在95%乙醇中漂去浮色5-10秒，然后进入质量浓度为0.5%的95%乙醇固绿染液，保持30秒，所述95%乙醇为体积百分浓度；然后进行脱水：经三级分析纯无水乙醇处理，即为进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级，每级30秒-1分钟；脱水后进入透明处理：经三级分析纯二甲苯处理，即为进入二甲苯Ⅰ级、二甲苯Ⅱ级、二甲苯Ⅲ级，每级20分钟；上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇或二甲苯；（11）封片将上述透明好的切片从二甲苯中取出，用纱布擦干净多余的二甲苯，然后用中性树胶封片，即在要观察的组织块附近滴上封片剂，沿着一边轻轻地盖上盖玻片、以防止产生气泡，最后自然风干后即在显微镜下观察。
所属类别：	发明专利