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原文传递检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用

专利名称：	检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用
摘要：	本发明涉及一种检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，所述诊断试纸在受试者体外分析受试者的尿液样品中的苯丙酮尿症疾病标记物的存在的方法中使用，所述方法包括以下步骤：S1：采用一次性洁净容器收集新鲜尿液样品，在进行检测前，将尿液样本恢复至室温20‑25℃，S2：取出诊断试纸，并在0.5h内使用；S3：将试纸条的下端插入尿液样品中，尿液液面低于试纸条的标记线；S4：至少8s后取出，放于干净平整的台面上；S5：等待色带的出现，检测结果在4‑5分钟时判读。本发明的有益效果是：通过采集新生儿尿液以诊断试纸法来筛查苯丙酮尿症。最大的优点是无创、简便、标本易得。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	翁炳焕;陈丹青;沈筱芸;许亚丽;徐威;周志斌
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910659911.8
公开号：	CN110441524A
代理机构：	浙江永鼎律师事务所
代理人：	郭小丽
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310000浙江省杭州市西湖区浙大路38号
主权项：	1.检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，所述诊断试纸在受试者体外分析受试者的尿液样品中的苯丙酮尿症疾病标记物的存在的方法中使用，所述方法包括以下步骤： S1：采用一次性洁净容器收集新鲜尿液样品，在进行检测前，将尿液样本恢复至室温20-25℃， S2：取出诊断试纸，并在0.5h内使用； S3：将试纸条的下端插入尿液样品中，尿液液面低于试纸条的标记线； S4：至少8s后取出，放于干净平整的台面上； S5：等待色带的出现，检测结果在4-5分钟时判读。 2.根据权利要求1所述检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：步骤S1中以早晨5：00至6：00之间的晨尿为最优测试尿样，尿样如果呈现浑浊状，先离心、过滤或者待其沉淀后取上清液检测，当采集的尿样不能及时检测时，尿液样本放于2-5℃冷藏保藏36小时，最长不得超过48h，如果需要长期保藏，则需冷冻于-15℃，同时避免反复的冷冻和解冻。 3.根据权利要求1所述检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：所述抗体的制备方法包括如下步骤：步骤S1: 备置纯度≥95%的半抗原D-Phe，并备置纯度≥95%的筛选原L-Tyr及 L-Try；步骤S2：免疫原制备，将半抗原和筛选原分别与KLH和BSA偶联，制成D-Phe-KLH、D-Phe-BSA、L-Tyr -KLH、L-Tyr- BSA、L-Try -BSA和L-Try- KLH；步骤S3：动物免疫，分别设置A组和B组，其中A组5只Balb/c小鼠，用D-Phe-KLH免疫，然后用D-Phe-BSA检测；B组5只Balb/c小鼠，用D-Phe-BSA免疫，然后用D-Phe-KLH检测，免疫7天后，用间接ELISA和竞争ELISA方法检测免疫动物血清，确定免疫应答水平；步骤S4：细胞融合和筛选，将步骤S3符合免疫应答水平要求的动物免疫细胞与鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合；步骤S41：初筛，用间接ELISA方法筛选融合细胞培养上清液，挑选出能产生抗苯丙氨酸抗体的阳性克隆；步骤S42：复筛，对初筛得到的能产生抗苯丙氨酸抗体的所有阳性克隆，进行复筛确认；步骤S43：竞争ELISA检测，将经复筛确认的能产生抗苯丙氨酸抗体的所有阳性克隆进行竞争ELISA检测；步骤S44:阳性克隆的扩大培养和冻存，将上述阳性克隆细胞转到24孔板扩大培养，每个扩大培养的克隆收集2ml以上的上清液，用于间接ELISA和竞争ELISA检测，冻存能产生抗苯丙氨酸特异性抗体的阳性克隆细胞；步骤S5：亚克隆，采用有限稀释法对上述阳性克隆进行亚克隆，以获得单克隆细胞，用间接ELISA和竞争ELISA方法进行亚克隆筛选，每个阳性克隆选择至少2个稳定的子克隆进行扩增和低温保存；步骤S6：抗体生产，分别对亚克隆筛选的单克隆细胞进行抗体生产，采用ProteinA/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液中。 4.根据权利要求3所述检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：所述诊断试纸的制备方法包括如下步骤：步骤S7：样品垫的制备，将硝酸纤维素膜切成2530cm，用样品垫处理液浸泡30分钟上，取出烘干，切成相应宽度的2.530cm样品垫条备用；步骤S8：胶体金结合垫的制备：用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金液冷却备用，调整pH值至一定值，加入一定量步骤S6制备的抗体，搅拌30分钟，加入一定量的BSA，搅拌10分钟，离心去上清，加入适量的复溶液复溶至适量体积，振荡均匀，喷涂在硝酸纤维素膜上，37℃干燥4小时以上，沿着喷胶体金复溶液的方向，在保证每条胶体金的完整的情况下，裁成130cm胶体金结合垫备用；步骤S9：吸水材料的制备：将吸水板裁成3.330cm条形备用；步骤S10：金膜组合，将吸水材料、胶体金结合垫、样品垫按照顺序层叠粘在PVC板上，形成成型板；步骤S11：分切：将上述成型板根据需要切成2.5-6mm的条；步骤S12：装袋和封口：将上述条装入铝泊袋中封口备用；步骤S13：外包：将袋装产品装入外包装盒。 5.根据权利要求3所述的检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：步骤S2中偶联的具体操作方法如下： 1.5mg半抗原和筛选原分别与2mgKLH和BSA溶于1.8mlpbs缓冲液中，缓慢滴加1%戊二醛20ul，再加0.15mol/LNaCl至蛋白终浓度为0.1mg/ml ，置振荡器中轻微振荡2.5到3小时，然后添加0.05-0.1mg甘氨酸，轻微振荡20-30min即可。 6.根据权利要求3所述的检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：步骤S3中动物免疫的具体操作方法如下：免疫前采血，然后第一次免疫，剂量和途径为50μg/只，皮下免疫，佐剂为弗氏完全佐剂，第二次免疫为首次免疫后第14天，25μg/只，皮下免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，首次免疫后第21天，采血检测一次，第28天第三次免疫，25μg/只，皮下免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，第35天采血检测，第50±7天，最后一次免疫，25μg/只，静脉免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂。 7.根据权利要求3所述的检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：步骤S4细胞融合的动物细胞，其免疫应答水平OD值＞1.0，效价达到1:8000。 8.根据权利要求3所述的检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：步骤S6中抗体质量的控制方法具体为：采用SDS-PAGE，间接ELISA和竞争ELISA进行，抗体浓度采用NanoDrop2000测定，抗体亲和力采用SPR Biacore测定。 9.根据权利要求4所述的检测苯丙酮尿症标记物的抗体在制备诊断试纸中的应用，其特征在于：步骤S8中调节pH值7.5-8.4，抗体的添加量为每1.0ml胶体金溶液添加5-8μL0.1mg/mL的抗体，BSA溶液的浓度为1%，添加量为0.1-0.3ml。
所属类别：	发明专利