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原文传递一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法

专利名称：	一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法
摘要：	本发明公开了一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，包括步骤：制备实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品；制备发光细菌菌液；将发光细菌菌液加到96孔细胞培养板中，然后置于酶标仪，30min后测定初始光密度值和初始生物发光值；向发光细菌菌液中加入实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品，前1h每30min测一次光密度值和生物发光值，随后每1h测一次，测试不低于24h；获取光密度突变时间和生物发光突变时间；计算急性发光抑制率、慢性发光抑制率和生长抑制率。本发明可同时评估待测物质对发光细菌的生长作用、急性和慢性毒性效应，准确率高，实现了毒性测试的高通量化，测试效率高。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京信息职业技术学院
发明人：	袁楠楠;鲍安平
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910623712.1
公开号：	CN110441292A
代理机构：	南京纵横知识产权代理有限公司
代理人：	董建林
分类号：	G01N21/76(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	210023江苏省南京市栖霞区仙林大学城文澜路99号
主权项：	1.一种发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：制备若干不同浓度的实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品；在无菌条件下制备发光细菌菌液；将所述发光细菌菌液加入到96孔细胞培养板中，然后将96孔细胞培养板置于酶标仪中，30min后测定初始光密度值和初始生物发光值；向发光细菌菌液中加入实验样品、阴性对照样品和阳性对照样品，前1h每30min测一次光密度值和生物发光值，随后每1h测一次，测试不低于24h，测试过程中每5～10min振动一次96孔细胞培养板；做出阴性对照样品的光密度值和生物发光值随时间变化曲线，分别获得光密度突变时间和生物发光突变时间；根据实验样品的生物发光值计算急性发光抑制率，根据实验样品在所述生物发光突变时间的生物发光值计算发光细菌的慢性发光抑制率，根据实验样品在所述光密度突变时间的光密度值计算发光细菌的生长抑制率。 2.根据权利要求1所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，通过公式(1)计算所述急性发光抑制率： Ra＝100(LNC-Lt)/LNC (1) 式(1)中Ra表示急性发光抑制率，LNC表示30min时阴性对照样品的平均生物发光值，Lt表示同一时刻实验样品的平均生物发光值。 3.根据权利要求1所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，通过公式(2)计算所述慢性发光抑制率： Rc＝100(INC-It)/INC (2) 式(2)中Rc表示慢性发光抑制率，INC表示阴性对照样品在生物发光突变时间的平均生物发光值，It表示同一时刻实验样品的平均生物发光值。 4.根据权利要求1所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，通过公式(3)计算所述生长抑制率： Rg＝100(ODNC-ODt)/(ODNC-OD0) (3) 式(3)中Rg表示生长抑制率，ODNC表示阴性对照样品在光密度突变时间的平均光密度值，ODt表示同一时刻实验样品的平均光密度，OD0表示阴性对照样品对应的发光细菌菌液的初始光密度值。 5.根据权利要求1所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，所述实验样品为水相实验样品或有机相实验样品，对应的所述阴性对照样品为水相阴性对照样品或有机相阴性对照样品。 6.根据权利要求5所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，所述水相实验样品的制备方法包括步骤：将待检沉积物与3％NaCl溶液混合，在摇床中20℃条件下振荡12h，以滤膜过滤获得水相浸提液母液，然后以3％NaCl溶液稀释获得不同浓度水相实验样品；以3％NaCl溶液为水相阴性对照样品。 7.根据权利要求5所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，所述有机相实验样品的制备方法包括步骤：将待检沉积物与按体积比1：1混合的丙酮和己烷混匀，在微波消解炉中115℃条件下处理20min，以滤膜过滤，滤液用氮吹仪蒸发干，残渣溶解于二甲基亚砜中，得到有机相浸提液，将有机相浸提液溶解于3％NaCl溶液，获得浓度为1％的有机相浸提液母液，以3％NaCl溶液稀释获得不同浓度有机相实验样品；以3％NaCl溶液为溶剂，配制体积浓度为1％的二甲基亚砜溶液为有机相阴性对照样品。 8.根据权利要求1所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，所述发光细菌菌液的制备方法包括以下步骤：将发光细菌溶液置于琼脂板培养，然后挑单个菌落接种至培养基中培养至浊度达到500～600FTU，离心去除上清液，将残渣重悬浮于培养基，分装后用液氮快速冷冻，于-80℃冻存；将冻存的发光细菌置于室温解冻，在培养基琼脂板划线接种并培养过夜，将得到的细菌溶液用培养基稀释，得到发光细菌菌液。 9.根据权利要求1所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，以培养基和所述NaCl溶液的混合液作为空白对照样品；以9mg/L的3，5-二氯苯酚和0.1mg/L的氯霉素为阳性对照样品。 10.根据权利要求1所述的发光细菌的生长作用和急慢性毒性检测方法，其特征在于，在酶标仪中测试光密度值和生物发光值的温度条件为10～15℃。
所属类别：	发明专利