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原文传递一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用

专利名称：	一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用
摘要：	本发明涉及一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用，属于电化学发光检测技术领域。开发并首次验证了铕掺杂磷酸钆在低电位下激发可达到的高效电化学发光行为，一方面解决了发光材料在电极上的固定问题，另一方面解决了抗原抗体活性的有效保存问题。根据对不同浓度的原降钙素响应的电化学发光信号强度不同，实现对原降钙素的检测。通过采用F检验、T检验展示本方法的准确度和精密度，测试结果均小于理论值，说明该方法准确可靠。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	魏琴;薛经纬;鞠熀先;王萌迪;赵磊;孙晓君;杨兴龙
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910715125.5
公开号：	CN110441293A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N21/76(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	250022山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的铕掺杂磷酸钆分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；（3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素抗体1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；（7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的钯功能化的氧化亚铜立方晶捕获抗体孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干。 2.如权利要求1所述的一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，所述基底材料铕掺杂磷酸钆的制备，包括以下步骤：（1）酚醛树脂模板球的制备在45~55 mL去离子水中加入0.1806 g 3-氨基酚和质量分数为25%的氨水90~100 µL，在30ºC下搅拌10 min，形成清晰的溶液;加入100~150 µL甲醛溶液后，30 s后溶液变白;再持续搅拌4 h后，将所得混合物转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，在100ºC下保持24 h;最后用去离子水和酒精洗涤两次将样品离心纯化，最终在空气中干燥；（2）铕掺杂磷酸钆的制备首先，制备前驱体：将3 g尿素、0.5~1.5 mmol 硝酸钆水溶液、0.01~0.08 mmol硝酸铕水溶液和0.1~0.3 g上述合成的树脂球分别加入到20~30 mL去离子水中; 搅拌10~40 min，超声15 min，最后将混合物放入100 mL圆底烧瓶中，在70~100ºC下加热3 h;离心收集沉淀，用去离子水洗涤三次，得到碳酸氢氧钆前驱体;将得到的前驱体超声分散于25 mL去离子水中;然后将0.1~0.2 g溶于10mL去离子水的磷酸氢氨溶液滴加到上述溶液中; 10 min后在搅拌下加入0.1~0.2 g的十六烷基三甲基溴化铵，最终将混合溶液转移到50 mL高压反应釜中并在180ºC下加热12 h;然后用去离子水和乙醇先后洗了三遍将所得样品纯化; 最后，将所得样品干燥后在500ºC下煅烧2 h，得到分级铕掺杂磷酸钆空心球。 3.如权利要求1所述的一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用，其特征在于，所述钯功能化的氧化亚铜标记的原降钙素检测抗体溶液的制备，包括以下步骤：（1）钯纳米晶的制备首先，将0.0100~0.1000 g 氯化十六烷基三甲基铵、9.125 mL去离子水和0.2 ~0.9 mL10 mM 氯钯酸溶液分别注入样品瓶中，将其保存在一个35ºC水浴环境中；随后，300~800 µL1 mM溴化钾溶液和1 mM 50 µL 碘化钾溶液添加并混合; 10 min后，注射0.05 M抗坏血酸0.5~1.8 mL; 保持水浴30分钟，在7500转/分的离心转速下两次10分钟; 最终产品于400 µL的去离子水中；（2）钯功能化的氧化亚铜的制备将0.020~0.100 g十二烷基硫酸钠溶于去离子水，0.1 M氯化铜溶液0.03~0.10 mL和上一步制备的0.02~0.10 mL钯纳米晶溶液加入其中后注入1.0 M的氢氧化钠溶液0.25 mL，十秒后注入0.2 M的盐酸羟胺溶液0.15 mL; 反应2 h后，纳米晶溶液为以3000~8000转/分的转速下离心3分钟，用未知比例的去离子水和乙醇混合溶液分别冲洗3次，最终得到的产品分散于600 µL的无水乙醇；（3）钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液的制备将1mL 10~100 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4 °C振荡1 h; 12000 转/分离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中; 随后200~600 μL 0.1% 牛血清白蛋白的加入溶液中用来封闭特异性活性位点; 离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的捕获抗体，在4°C下孵化10~15 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1~3 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到钯功能化的氧化亚铜捕获抗体孵化液，储存在4 °C下备用。 4.如权利要求1一种基于蛋白活性保护的电化学发光传感器制备方法及应用，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为700 V，循环伏安扫描电位范围为-1.15~0 V，扫描速率为0.12 V/s；（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为0.5~1.5mol/L过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
所属类别：	发明专利