详情

原文传递用于CCN1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用

专利名称：	用于CCN1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用
摘要：	本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于CCN1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用。方法包括：将(Nf@Ru)溶液与GCE的表面接触，获得Nf@Ru/GCE；然后在氯金酸溶液中进行电沉积，获得AuNPs/Nf@Ru/GCE；将AuNPs/Nf@Ru/GCE与修饰有巯基的ssDNA接触，得到ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。本发明的检测灵敏度可达到0.00502pg/mL，动态范围为0.00001‑100ng/mL。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	重庆;50
申请人：	重庆市人民医院
发明人：	牛长春;廖璞;李甜;万雅芳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910534579.2
公开号：	CN110208346A
代理机构：	重庆志合专利事务所(普通合伙)
代理人：	胡荣珲
分类号：	G01N27/30(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	400012 重庆市渝中区中山一路312号
主权项：	1.一种生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括： (1)将二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液与玻碳电极的表面进行第一接触，获得第一接触产物Nf@Ru/GCE； (2)将所述Nf@Ru/GCE在氯金酸溶液中进行电沉积，以在所述Nf@Ru/GCE的表面上修饰纳米金颗粒，获得电沉积产物AuNPs/Nf@Ru/GCE； (3)将所述AuNPs/Nf@Ru/GCE与修饰有巯基的ssDNA进行第二接触，以形成金硫键，从而将ssDNA固载在所述AuNPs/Nf@Ru/GCE表面，得到第二接触产物ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE；其中，所述ssDNA中修饰有巯基的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的方法，其中，在将所述玻碳电极与二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液接触之前，该方法还包括对所述玻碳电极进行镜面抛光，获得镜状表面；其中，将二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液滴加到所述镜状表面进行第一接触；优选的，使用三氧化二铝抛光粉末对所述玻碳电极进行镜面抛光。 3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一接触的条件包括：温度为35-40℃，时间为2.5-3.5小时；和/或所述电沉积的条件包括：电压为0.1-0.3V，时间为5-15s；和/或所述第二接触的条件包括：温度为2-6℃，时间为8-15小时。 4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括：将ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE在1-己硫醇中进行第三接触，得到第三接触产物HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE；优选的，所述第三接触的温度为2-6℃，时间为30-50min。 5.权利要求1-4中任意一项所述的方法制备的生物传感器。 6.权利要求5所述的生物传感器非治疗目的地在CCN1蛋白的电化学发光检测中的应用。 7.一种CCN1蛋白的电化学发光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求5所述的生物传感器；优选的，该试剂盒还含有：链霉亲和素的磁珠、三丙胺、CCN1融合纯化蛋白、CCN1捕获抗体、CCN1检测抗体、生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链、以及SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的引物和SEQ IDNO.4所示的引物。 8.一种非治疗目的地CCN1蛋白的电化学发光检测检测方法，其特征在于，该方法包括： (1)制备生物素标记的CCN1蛋白捕获抗体CAb-biotin，以及SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链和CCN1蛋白检测抗体的偶联物DAb-Initiator I； (2)制备CCN1融合纯化蛋白、CAb-biotin、DAb-Initiator I和链霉亲和素的磁珠的结合物DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB，然后将所述结合物与SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的H1引物和SEQ ID NO.4所示的H2引物进行接触，以使得SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链被Fc-H1-H2双链DNA所置换，得到置换产物； (3)将所述置换产物加入到权利要求5所述的生物传感器上进行电化学发光检测。 9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(1)中，CAb-biotin的制备方法包括：将生物素与CCN1蛋白捕获抗体混合并接触反应，将反应后的产物通过滤膜进行分离纯化，最后将纯化产物溶解于缓冲液得到CAb-biotin；和/或 DAb-Initiator I的制备方法包括：将SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链与N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺混合并接触反应，以活化所述引发链上的羧基，然后加入CCN1蛋白检测抗体和N-羟基琥珀酰亚胺继续反应，将反应完全的产物通过滤膜进行分离纯化，最后将纯化产物溶解于缓冲液得到DAb-Initiator I。 10.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(2)中，所述结合物的制备方法包括：将CAb-biotin与链霉亲和素的磁珠接触反应，得到CAb-biotin/SA@MB；将CAb-biotin/SA@MB与CCN1融合纯化蛋白接触反应，得到CCN1/CAb-biotin/SA@MB；将CCN1/CAb-biotin/SA@MB与DAb-Initiator I接触反应，得到DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB；优选的，步骤(3)中，所述电化学发光检测的方法包括将：将所述置换产物加入到所述生物传感器表面，在35-40℃的条件下孵育80-150分钟，然后浸入含有三丙胺作为共反应试剂的缓冲液中进行电化学发光检测。
所属类别：	发明专利