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原文传递一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法

专利名称：	一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法
摘要：	本发明具体涉及一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法。本发明采用丙酮沉淀法，充分裂解后的蛋白溶液加入冷丙酮和30mM DTT，涡旋混匀，‑20℃沉淀，离心时去掉上清后采用质谱更兼容的溶液重悬蛋白，SDS等表面活性剂能够和蛋白结合，丙酮沉淀蛋白时会一起沉淀下来，所以丙酮沉淀一次只能去掉部分的SDS，待重悬的蛋白进行还原烷基化后，再次加入冷丙酮和10mM DTT，‑20℃沉淀，离心去掉上清后再次采用质谱更兼容的溶液重悬蛋白，经过两次丙酮沉淀与裂解液重悬置换，SDS对后续实验的影响基本消除，并且每个样品只需3ml左右的丙酮，成本大约0.1元，相较于超滤管，节省了更多成本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉金开瑞生物工程有限公司
发明人：	陈亚运;华权高;李立;赵海义;鲁思琴;李如萍;舒芹;张雪娇
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910804757.9
公开号：	CN110501437A
代理机构：	武汉蓝宝石专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	严超
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道666号武汉国家生物产业基地项目B、C、D区研发楼B1楼
主权项：	1.一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：去石蜡、冷冻干燥、裂解、加热、离心、丙酮沉淀、离心复溶、还原、烷基化、二次丙酮沉淀、离心。 2.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，裂解的条件为：用液氮研磨组织，完全磨成粉末后加入裂解液，混匀后冰浴超声破碎。 3.根据权利要求2所述的一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，裂解液包括0.1M Tris-HCl、0.1M DTT、1mM PMSF、2mM EDTA,pH为8.0，超声破碎的条件为：超声破碎2秒，间歇时间为3秒，功率为150-250W，超声裂解的时间为10-20min。 4.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，加热的条件为：加入终浓度为4％的SDS，95-105℃金属浴震荡80-100min。 5.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，丙酮沉淀的条件为：加入3-5倍体积的冷丙酮，再加入30mM DTT,混匀，-20℃静置沉淀；二次丙酮沉淀的条件为：加入3-5倍体积的冷丙酮，同时加入10mM DTT，混匀，-20℃静置沉淀。 6.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，离心复溶的条件为：离心后去上清，沉淀中加入含有8M尿素、0.1M TEAB的溶液进行溶解。 7.根据权利要求1所述的一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)去石蜡：去除石蜡包埋样本中的石蜡； 2)冷冻干燥：将去除石蜡的样本进行冷冻干燥至完全干燥； 3)裂解：先液氮研磨再加入裂解液最后采用冰浴超声破碎； 4)加热：向裂解后的样品中加入终浓度为4％的SDS混匀，95-105℃金属浴震荡80-100min，冷却至室温； 5)离心：取上清； 6)丙酮沉淀：加入冷丙酮，再加入30mM DTT,混匀后，-20℃静置沉淀； 7)离心复溶：离心取上清，沉淀风干后加入含有8M尿素、0.1M TEAB的溶液进行溶解； 8)还原：加入0.5-1.5％体积比的1M DTT，50-70℃水浴25-40min； 9)烷基化：加入8-12％体积比的0.55M IAM，常温暗室静置25-35min； 10)二次丙酮沉淀：加入冷丙酮，同时加入10mM DTT，混匀，-20℃静置沉淀； 11)离心：离心去上清，沉淀即为提取得到的蛋白质。 8.如权利要求1所述的石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，按照上述方法提取石蜡包埋样本中的蛋白质，对提取得到的蛋白质依次进行复溶、酶解和脱盐处理，经过脱盐处理后的样品进行HPLC分组分、质谱检测和数据分析。 9.根据权利要求8所述的石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，酶解包括以下步骤：取复溶后的蛋白质溶液，依次加入TEAB、CaCl2溶液、胰酶，震荡混匀离心，37℃水浴过夜。 10.根据权利要求8所述的石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，脱盐处理包括以下步骤： 1)将水浴过夜后的样本离心取上清，加入FA酸化，震荡混匀后离心取上清备用； 2)采用甲醇和FA活化和酸化C18柱料； 3)将酸化后的样品加入步骤2)中的柱料中缓慢旋转反应； 4)用FA和ACN溶液清洗，离心收集上清液。
所属类别：	发明专利