详情

原文传递一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法

专利名称：	一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备和检测方法
摘要：	本发明涉及病毒检测技术领域，公开了一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条及其制备方法，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，所述结合垫上包被有金标探针，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针；本发明同时公开了一种采用上述胶体金试纸条检测石斑鱼虹彩病毒的方法。本发明的胶体金试纸条基于核酸适配体结合侧流生物传感器以及胶体金显色的原理制成，具有较高的特异性和灵敏度，组装简单，便于携带，检测方法操作简便，可以对石斑鱼虹彩病毒进行高效、准确、快速的现场实时检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	华南农业大学
发明人：	秦启伟;刘嘉昕;王劭雯;曾令文;李趁;俞也频;魏世娜
专利状态：	有效
申请日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910873701.9
公开号：	CN110618259A
代理机构：	广州文智专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	刘敏
分类号：	G01N33/52(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510000 广东省广州市天河区五山路483号
主权项：	1.一种检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫，其特征在于，所述结合垫上包被有金标探针，所述金标探针为5’端巯基修饰的核酸适配体，其核苷酸序列为：5’-SH-TATGTCCATGGCCGCATATT；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线固定有捕获探针，所述质控线固定有质控探针：所述捕获探针的核苷酸序列为：TTTGGACTATGTGGAAGTT；所述质控探针的核苷酸序列为：AATATGCGGCCATGGACATA。 2.根据权利要求1所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1.制备样品垫； S2.制备结合垫，在结合垫上包被金标探针； S3.硝酸纤维素膜的处理：采用喷金仪将捕获探针和质控探针以0.5-0.8μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜上划线得到检测线和质控线，所述检测线和质控线之间的距离为5～6mm； S4.胶体金试纸条的组装：将所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在所述底板上，各相邻的部件相互重叠2～3mm，然后将其整体切成4mm宽，避光保存。 3.根据权利要求2所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述S1具体为：将玻璃纤维置于含有0.5％TritonX-100、2％蔗糖、1％牛血清白蛋白(BSA)、50mM硼酸，pH 8.0的溶液中浸泡后，室温干燥12h制成。 4.根据权利要求2所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤： a.胶体金的合成：取200ml浓度为0.01％的HAuCl4溶液搅拌并加热至沸腾，加入8ml浓度为1％的柠檬酸三钠，待溶液变为葡萄酒红色，继续沸腾5min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到胶体金溶液； b.胶体金-核酸适配体复合物的制备：将步骤①所得胶体金溶液进行10倍浓缩，取400μl浓缩液加入金标探针，于4℃摇晃12h；然后加入浓度为10％的BSA，反应4h，得到胶体金-核酸适配体复合物；在所述复合物中添加1％的十二烷基硫酸钠至其终浓度为0.01％，再加入浓度为1.5mol/L的NaCl溶液使盐离子终浓度为150mM，所得复合溶液置于4℃反应12h； c.将步骤b所得的复合溶液以12000rpm的转速离心10～20min，并用缓冲液清洗三次，丢弃上清，将所得颗粒重悬在150μl的缓冲液中，得到胶体金-核酸适配体结合溶液，于4℃保存； d.取步骤c所得的胶体金-核酸适配体结合溶液2～3μl滴加在所述结合垫上，室温风干5min，即得包被有金标探针的结合垫。 5.根据权利要求4所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述步骤c中的缓冲液为含有20mM Na3PO4、5％BSA、0.25％吐温以及10％蔗糖的溶液。 6.一种如权利要求1-5任一项所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤： ①病毒孵育：取100μl磷酸盐缓冲液，加入捕获适配体(Aptamer1)和扩增适配体(Aptamer2)，使所述捕获适配体和扩增适配体的浓度分别为200nM，再加入石斑鱼虹彩病毒(SGIV)感染的细胞孵育10～15min，得到含SGIV的混合物； ②链置换反应：将2μl经链霉亲和素修饰的磁珠加入所述混合物中，振荡10～15min，得到Aptamer1-SGIV-Aptamer2-磁珠复合物，用磁器分离架将其收集，并用PBST洗涤三次，将复合物转移到离心管中进行链置换反应，得到链置换反应产物； ③取样检测：取步骤②的链置换反应产物滴加在胶体金试纸条的样品垫上，反应5min，观察胶体金试纸条的显色结果； ④结果判读：阳性反应：胶体金试纸条的检测线、质控线均显色；阴性反应：胶体金试纸条的检测线不显色，质控线显色。 7.根据权利要求6所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的检测方法，其特征在于，所述步骤②中，链置换反应的温度为37℃，时间为30min。 8.根据权利要求7所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的检测方法，其特征在于，所述步骤②中的链置换反应体系中，按体积量计，包括：SDA引物2μl、脱氧核苷三磷酸酯(dNTPs)2μl、聚合酶(Klenow-exo)0.6μl、切刻内切酶(Nt.BbvCI)0.4μl、SDA-buffer-2 2μl、10％BSA 1μl、超纯水12μl。 9.根据权利要求8所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的检测方法，其特征在于，所述SDA引物的核苷酸序列为：GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG。 10.根据权利要求6-9任一项所述的检测石斑鱼虹彩病毒的胶体金试纸条的检测方法，其特征在于，所述捕获适配体(Aptamer1)的序列为：TATGTCCATGGCCGCATATTGGGAAGGTTGGTTTGGACTATGTGGAAGTT-Bio；所述扩增适配体(Aptamer2)的序列为：TATGTCCATGGCCGCATATTGGGAAGGTTGGTTTGGACTATGTGGAAGTTGCTGAGGCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC。
所属类别：	发明专利