详情

原文传递一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法

专利名称：	一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法
摘要：	本发明属于食品安全快速检测领域，涉及一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法；步骤为：首先制备荧光特性好、水溶性好及生物相容性好的两种荧光碳量子点，并且通过调节两种碳量子点的掺杂比例，制备一系列具有不同荧光特性的荧光编码微球；用碳量子点荧光编码微球，对应标记肠毒素的抗体，得到多种荧光抗体探针；最后将多种荧光抗体探针等质量溶解在含有蔗糖和吐温20的磷酸缓冲液中，得到含有多种荧光抗体探针的混合液；然后均匀喷涂到玻璃纤维膜上，作为结合垫，以此制备荧光微球免疫层析试纸条，实现多种肠毒素的同时定性及定量检测；本发明能够提高检测效率和准确率、实现大批食品样品的快速检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏大学
发明人：	邹小波;胡雪桃;石吉勇;李艳肖;甘子玉;徐艺伟;李亚惠
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910799967.3
公开号：	CN110618273A
分类号：	G01N33/58(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
主权项：	1.一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、制备碳量子点荧光编码微球；将蔗糖A加入磷酸A中，搅拌后置于微波炉中进行加热A，得到碳量子点，记为CQD1；再取蔗糖B加入磷酸B中，搅拌后置于微波炉中进行加热B，得到碳量子点，记为CQD2；然后将CQD1和CQD2以m种不同配比混合，得到m种碳量子点混合物，分别分散于氯仿中，分别再加入聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、十二烷基磺酸钠进行第一次超声分散，最后再加入氢氧化钠进行第二次超声分散，经离心、洗涤后得到m种碳量子点荧光编码微球，记为QB1、QB2、QB3、……、QBm；步骤2、取m种金黄色葡萄球菌肠毒素，分别记为SE1、SE2、SE3、……、和SEm；m种金黄色葡萄球菌肠毒素对应的抗体分别记为Ab1、Ab2、Ab3、……、Abm；先取步骤1制备的荧光编码微球QB1、牛血清蛋白和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺加入磷酸缓冲液中，进行第一次搅拌反应，随后加入SE1的抗体Ab1和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，进行第二次搅拌反应，反应结束后离心，获得荧光编码微球标记抗体探针QB1@Ab1；同理，按照上述步骤，将QB2与SE2的抗体Ab2结合，将QB3与SE3的抗体Ab3结合，……，将QBm与SEm的抗体Abm结合，最后获得QB2@Ab2、QB3@Ab3、……、QBm@Abm荧光抗体探针；即用步骤1中得到的m种碳量子点荧光编码微球，一一对应标记肠毒素的抗体，得到m种荧光抗体探针；最后将m种荧光抗体探针等质量溶解在含有蔗糖和吐温20的磷酸缓冲液中，得到含有m种荧光抗体探针的混合液；步骤3、荧光编码微球试纸条的制备； S1、将步骤2中制备的荧光抗体探针混合液均匀喷涂到玻璃纤维膜上，作为结合垫,烘干备用；然后在硝酸纤维素膜上标记出m条测试线T和1条质控线，测试线分别记为T1、T2、T3、……、和Tm，质控线记为C1，所述测试线和质控线的线条保持一定的宽度，线条之间保持一定的间距；取m种金黄色葡萄球菌肠毒素抗原，分别记为SE1-BSA、SE2-BSA、SE3-BSA、……、SEm-BSA；然后用喷膜机将SE1-BSA喷至测试线T1处，SE2-BSA喷至测试线T2处，……、SEm-BSA喷至测试线Tm处，完成测试线的制备；再将羊抗鼠IgG免疫球蛋白喷至质控线C1处，完成质控线的制备；将得到硝酸纤维素膜烘干备用； S2、取PVC衬板作为试纸条的基底，在PVC衬板基底上由左至右分别粘贴样品垫、结合垫、具有m条测试线T和1条质控线C1的硝酸纤维素膜和吸收垫；两个相邻粘贴物之间互相重叠，样品垫右端和结合垫左端重叠，结合垫右端和硝酸纤维素膜左端重叠，硝酸纤维素膜右端和吸收垫左端重叠；粘结完成后，适当裁剪，得到荧光编码微球试纸条。 2.根据权利要求1所述的一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1中所述微波炉的功率为700～900W；所述加热A的时间为60～120s；所述加热B的时间为20s～50s；所述蔗糖A和磷酸A的用量比为0.1～2g：5～15mL；所述蔗糖B和磷酸B的用量比为0.1～2g：5～15mL。 3.根据权利要求1所述的一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述CQD1和CQD2混合时的质量比为0～3：0～2.5，且CQD1和CQD2不同时为0。 4.根据权利要求1所述的一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述碳量子点混合物、氯仿、聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、十二烷基磺酸钠和氢氧化钠的用量比为0.2～0.8g：5～10L：1～2g：1～2g：0.1～0.5g：0.1～1g；所述第一次超声分散的时间为5～20min，第二次超声分散的时间为15～30min。 5.根据权利要求1所述的一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述进行第一次搅拌反应时间为30min～60min；第二次搅拌反应的时间为60min～120min。 6.根据权利要求1所述的一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述荧光编码微球QB1、牛血清蛋白、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、磷酸缓冲液、抗体和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的用量比为1～10μg：10～100mg：1～2mg：10～20mL：10～20μg：0.5～1mg；所述荧光抗体、蔗糖、吐温20和磷酸缓冲液的用量比为3～30μg：5～20mg：0.1～2mL：5～15mL；所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为7.4。 7.根据权利要求1所述的一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，步骤3的S1中，所述测试线和质控线的线条保持一定的宽度为2mm～5mm，线条之间保持一定的间距为3～8mm；所述烘干的温度为35～40℃；所述荧光抗体探针混合液均匀喷涂到玻璃纤维的喷量为1～20μL/cm；所述金黄色葡萄球菌肠毒素抗原喷至测试线的喷量为5～20μL/cm；所述羊抗鼠IgG免疫球蛋白喷至质控线C1的喷量为5～20μL/cm。 8.根据权利要求1所述的一种同时检测多种金黄色葡萄球菌肠毒素的荧光编码微球试纸条的制备方法，其特征在于，步骤3的S2中，所述重叠部分的宽度为2～4mm。 9.根据权利要求1～8任一项所述方法制备的荧光编码微球试纸条用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素的用途，其特征在于，包括以下步骤： (1)配制肠毒素溶液，滴加至荧光编码微球试纸条的样品垫上，静置反应一段时间后将试纸条置于便携式荧光成像仪中，记录测试线和质控线的荧光颜色及荧光强度的变化情况；根据肠毒素浓度由低到高，对应排列测试线不同的荧光图片；通过排列测试线T1的荧光图片，建立检测肠毒素SE1的荧光比色卡，记为K1；排列测试线T2的荧光图片，建立检测肠毒素SE2的荧光比色卡，记为K2；排列测试线T3的荧光图片，建立检测肠毒素SE3的荧光比色卡，记为K3；……、排列测试线Tm的荧光图片，建立检测肠毒素SEm的荧光比色卡，记为Km；进一步使用荧光免疫层析读数仪读取测试线和质控线C1的荧光信号强度，利用测试线与质控线C1的荧光信号强度的比值和对应肠毒素浓度的线性关系建立标准曲线：Y＝A+BX，其中Y为测试线与质控线C1的荧光信号强度的比值，X为肠毒素的浓度，A为常数项，B为方程的系数； (2)食品样品中肠毒素的检测：食品样品的预处理参照标准《进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法电泳和免疫印迹法》，得到食品样品溶液；检测同步骤(1)，区别是将食品样品溶液替换肠毒素溶液，滴加至样品垫上，静置反应后，首先观察试纸条质控线C1处是否有荧光，若无荧光，表明该试纸条无效，需要使用新的试纸条重新检测食品样品溶液；若有荧光，则继续观察样品测试线T1、测试线T2、测试线T3、……、测试线Tm的荧光颜色，并分别与步骤(1)构建的荧光比色卡K1、K2、K3、……、Km对比，通过荧光颜色初步判定肠毒素的浓度范围，实现了肠毒素的可视化及半定量检测；通过荧光免疫层析读数仪获取测试线T1、T2、T3、……、Tm的荧光信号值，分别记为T1s、T2s、T3s、……、Tms；C1的荧光信号值记为C1s，通过计算测试线与质控线C1的荧光信号强度的比值，代入步骤(1)中建立的定量标准曲线，计算肠毒素的含量，由此实现了食品样品中m种肠毒素的快速和准确检测。 10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述肠毒素溶液的浓度为0～1mg/mL；所述反应一段时间为5～10min；所述步骤(1)和(2)中m≤6，且为正整数。
所属类别：	发明专利