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原文传递一种检测PD-L1和CD8抗原的免疫荧光试剂盒及应用方法

专利名称：	一种检测PD-L1和CD8抗原的免疫荧光试剂盒及应用方法
摘要：	本发明涉及一种检测PD‑L1和CD8抗原的免疫荧光试剂盒及应用其的检测方法；所述的试剂盒包括以下试剂：缓冲液CYP1、CYP2、CYPP、封闭液、检测PD‑L1的特异性抗体以及相应的荧光二抗、荧光标记的CD45抗体、荧光标记的CD8抗体、抗体稀释液、细胞核染色液。本发明还提出应用所述的试剂盒进行抗原检测的方法。本发明的试剂盒检测结果可以对实际用药进行指导，不仅能够反映整体肿瘤,包括原位癌和可能存在的不可见的微小转移灶负荷，同样可以反映CTC中PD‑L1的表达情况；根据PBMC中PD‑L1和CD8阳性细胞比例，可以为治疗药物的精准选择提供参考；在取材上比基于肿瘤组织的检测技术更加方便。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏莱尔生物医药科技有限公司
发明人：	郭志敏;樊晓婷;郭素杰
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910504472.3
公开号：	CN110632292A
代理机构：	南京科知维创知识产权代理有限责任公司
代理人：	许益民
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	225700 江苏省泰州市泰州医药高新技术产业园第五期标准厂房G102栋东半侧
主权项：	1.一种检测PD-L1和CD8抗原的免疫荧光试剂盒，包括以下试剂组分：名称数量单位总体积/质量 CYP1缓冲液 1 瓶 80ml CYP2缓冲液 1 瓶 15ml CYPP缓冲液 1 管 4.5ml 封闭液 1 管 3ml PD-L1抗体 1 管 200μl CD8抗体 1 管 100μl CD45抗体 1 管 200μl 荧光二抗 1 管 200μl 抗体稀释液 1 管 3ml 染色液 1 管 300μl 其中，所述的CYP1缓冲液为0.01M PBS加纯化水充分搅拌溶解调节pH至7.20-7.40后分装；所述的CYP2缓冲液是在0.01M PBS溶液中加入0.1％Triton X-100、0.5％Trehalose,充分搅拌溶解后分装；所述的CYPP缓冲液是在0.01M PBS溶液中加入0.2％Triton X-100，充分搅拌溶解后分装；所述的封闭液含PBS和BSA或者选用动物血清、0.5％～10％BSA或Fc受体抗体；所述的PD-L1抗体为PD-L1抗体的10倍浓缩液，分装于1.5ml棕色避光管；所述的CD8抗体为Alexa594标记的CD8抗体，分装于1.5ml棕色避光管；所述的CD45抗体为Alexa647标记的CD45抗体，分装于1.5ml棕色避光管；所述的荧光二抗为Alexa488标记的荧光二抗，分装于1.5ml棕色避光管；所述的抗体稀释液含Tris-HCl缓冲液、牛血清白蛋白；所述的染色液为取DAPI粉末，用超纯水稀释后加入抗淬灭剂ThermoFisher，分装；或者为Hoechst或碘化丙啶。 2.如权利要求1所述的一种检测PD-L1和CD8抗原的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液CYP1、CYP2、CYPP中含有表面活性剂和蛋白保护剂，表面活性剂可以采用0～10％的Triton X-100、saponin、Tween、NP-40、SDS或聚乙二醇；所述的蛋白保护剂可采用0～10％的BSA、海藻糖(Trehalose)或蔗糖。 3.一种应用如权利要求1或2所述的试剂盒进行PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：步骤一、CTC富集和PBMC涂片，具体操作步骤为： S1、取血液和其他体液样品，对其中的CTC进行富集； S2、取外周血，对其中的PBMC进行分离和涂片；步骤二、将富集的CTC和PBMC细胞涂片进行免疫荧光检测，具体检测方法步骤如下： S1、CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区； S2、吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1同上洗片3min×3次；吸去多余液体，加100～150μl封闭液室温封闭20～30min； S3、吸去多余封闭液，加100μl稀释好的PD-L1抗体和CD45抗体或CD8抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；其中CTC进行PD-L1+CD45抗体孵育，PBMC细胞涂片分别进行CD8和PD-L1+CD45抗体孵育； S4、避光，取CYP2 100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分； S5、加100μl稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育；37℃，25～30min或室温30～60min；CYP2洗3min×4次，吸去多余水分； S6、复染：取10μL DAPI染液，加至标本区； S7、盖上盖玻片，并吸去周边液体，用于下一步或置于2～8℃或-20℃环境下避光保存；步骤三、对样本进行镜检观察：将CTC样本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定；记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照；必要时可使用油镜观察；将PBMC样本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，记录PD-L1或CD8阳性细胞个数和总细胞数；步骤四、结果判断，具体为： CTC阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性且无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞； CTC阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性； PBMC阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性并且有完整的细胞核，计为一个阳性细胞； PBMC阴性细胞：目的蛋白荧光信号阴性，均记为阴性。 4.如权利要求3所述的一种PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述的检测方法中的CTC检测与荧光原位杂交技术联用，具体步骤为以下任一种：(i)先用免疫荧光检测再进行荧光原位杂交；(ii)先用荧光原位杂交再进行免疫荧光检测；(iii)同时进行免疫荧光检测和荧光原位杂交。 5.如权利要求3或4所述的一种PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述的检测方法还包括使用修复方法对样品进行处理的步骤，所述的修复方法包或酶消化修复、EDTA修复、高压修复或微波修复。 6.如权利要求5所述的一种PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述的检测方法进一步包含针对PD-L1抗体和白细胞共同抗原CD45对富集的细胞进行免疫荧光检测的步骤。 7.如权利要求3或4所述的一种PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述的步骤一中的步骤S1中，是使用去除血浆、红细胞、白细胞的阴性富集方法获得各种亚型的CTC；再使用室温或室温20％恒湿条件使玻片自然干燥，使用固定剂固定细胞及抗原。 8.如权利要求3或4所述的一种PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述的步骤一中的步骤S2，是采用如下方法： (1)取外周血0.5ml，加入0.5ml 1×PBS，吹打混匀； (2)取0.5ml淋巴细胞分离，将混匀后的外周血轻轻叠加到淋巴细胞分离上层； (3)离心1500rpm，5min； (4)小心吸取离心后的白膜层，尽可能将所有细胞都回收，但不要混入红细胞沉淀； (5)补加10ml 1×PBS，颠倒混匀后，离心1500rpm，5min； (6)弃上清，用0.5ml 1×PBS重悬，吹打混匀后，血球计数板计数，适当稀释后涂片； (7)使用室温或室温20％恒湿条件使玻片自然干燥； (8)使用固定剂固定细胞及抗原。 9.如权利要求8所述的一种PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述的固定剂选自乙醇、甲醇、福尔马林、丙酮、冰醋酸、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙烯醛、苦味酸、PLP液或ECD-G液。 10.如权利要求3或4所述的一种PD-L1和CD8抗原检测的检测方法，其特征在于，所述步骤四的结果判断过程中的排除标准为若细胞核碎裂无法确定是单个细胞，多个细胞核聚集则不能记为一个阳性细胞。
所属类别：	发明专利