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原文传递犬腺病毒1型单克隆抗体、可变区序列、杂交瘤细胞株及其应用

专利名称：	犬腺病毒1型单克隆抗体、可变区序列、杂交瘤细胞株及其应用
摘要：	本发明提供了具有特异性结合犬腺病毒1型Fiber蛋白的鼠单克隆抗体的可变区序列、特异性结合犬腺病毒1型Fiber蛋白的抗体，该抗体可以用于制备试剂盒和药物组合物。本发明的试剂盒克服了现有技术检测灵敏度低的问题，避免了漏检、假阴性现象发生，可高灵敏检测犬的多种靶标，还能高灵敏检测非犬动物的多种靶标；且具有快速、简便、准确的优势；本发明的药物组合物能有效预防和治疗CAV‑1导致的疾病。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河南;41
申请人：	洛阳普泰生物技术有限公司
发明人：	田克恭;邓均华;李凡
专利状态：	有效
申请日期：	2018-06-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201810664721.0
公开号：	CN110632298A
代理机构：	北京华夏正合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	韩登营
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	471003 河南省洛阳市高新区华夏路6号
主权项：	1.一种特异性结合犬腺病毒1型的的单克隆抗体的可变区序列，其中，所述单克隆抗体为单克隆抗体4F3或2F9；所述单克隆抗体4F3重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体4F3轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体2F9重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体2F9轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。 2.一种特异性结合犬腺病毒1型的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.IDNo.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；优选地，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段，所述抗体或所述抗体的片段仍保留特异性结合犬腺病毒1型的能力；更优选地，所述抗体为单克隆抗体4F3。 3.一种特异性结合犬腺病毒1型的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区所示序列或其简并序列编码或其序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；优选地，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段，所述抗体或所述抗体的片段仍保留特异性结合犬腺病毒1型的能力；更优选地，所述抗体为单克隆抗体2F9。 4.一种杂交瘤细胞4F3株，所述杂交瘤细胞4F3株分泌权利要求2所述的单克隆抗体4F3。 5.一种杂交瘤细胞2F9株，所述杂交瘤细胞2F9株分泌权利要求3所述的单克隆抗体2F9。 6.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的特异性结合犬腺病毒1型的抗体，以及药学上可接受的载体；所述特异性结合犬腺病毒1型的抗体选自一种或多种以下抗体：单克隆抗体4F3、单克隆抗体2F9、单克隆抗体4F3的重链可变区和轻链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体4F3的重链可变区和单克隆抗体2F9的轻链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体4F3的轻链可变区和单克隆抗体2F9的重链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体2F9的重链可变区和轻链可变区连接而成的单链抗体。 7.根据权利要求6所述的药物组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒1型感染相关疾病的药物中的应用。 8.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体4F3、有效量的所述单克隆抗体2F9，以及对犬腺病毒1型抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括部件：底板(5)，所述底板(5)具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述硝酸纤维素膜(3)与金标垫(2)接触或与样品垫(1)、金标垫(2)接触使得犬腺病毒1型抗原与所述单克隆抗体2F9的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体2F9，所述硝酸纤维素膜上包括检测线(6)和一条质控线(7)，所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体4F3，所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述单克隆抗体4F3固定含量为0.5-2.5mg/ml，所述单克隆抗体2F9标记时含量为5-70μg/ml；优选地，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的所述样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液；优选地，所述单克隆抗体4F3固定含量为0.8-2.0mg/ml，所述单克隆抗体2F9标记时含量为10-60μg/ml。 9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体2F9、4H1和/或1G5，所述硝酸纤维素膜(3)上包括二条或三条检测线，所述二条或三条检测线上分别固定化有所述单克隆抗体4F3、2B7和/或6E11；其中，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml，所述单克隆抗体1G5标记时含量为20～60μg/ml，所述单克隆抗体2B7固定含量为1～3mg/ml，所述单克隆抗体6E11固定含量为1～3mg/ml；所述犬副流感病毒单克隆抗体2B7重链可变区为SEQ ID No.5所示序列或其简并序列编码、轻链可变区为SEQ ID No.6所示序列或其简并序列编码，所述犬副流感病毒单克隆抗体4H1重链可变区为SEQ ID No.7所示序列或其简并序列编码、轻链可变区为SEQ ID No.8所示序列或其简并序列编码；所述犬瘟热病毒单克隆抗体6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌，所述犬瘟热病毒单克隆抗体1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌；优选地，所述相邻的所述检测线之间、离所述质控线最近的检测线与质控线之间的距离≥4mm。 10.一种免疫组化检测方法，其中，所述方法包括：步骤(1)采集感染动物组织样品，对所述组织样品进行修块，迅速置于福尔马林固定；优选地，所述感染动物组织样品为犬的肝、胆、肾、肠组织；步骤(2)将所述步骤(1)固定的组织样品经流水冲洗后脱水、透明、浸蜡，经包埋后切片、展片、裱片于用三氨丙基三乙氧基硅烷处理的玻片上，烤片；步骤(3)所述玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％H2O2静置以抑制内源性酶；步骤(4)使用热修复，或酶消化法处理所述烤片后的玻片以修复抗原，所述热修复包括高压热修复、煮沸热修复、或微波热修复；步骤(5)用磷酸盐缓冲液洗涤所述修复抗原，滴加封闭液如马血清、或牛血清白蛋白封闭；步骤(6)吸去封闭液后加入稀释的一抗，所述一抗为单克隆抗体4F3或2F9，孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤，加入酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗，孵育；以及步骤(7)用磷酸盐缓冲液洗涤，加入AEC或DAB显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。
所属类别：	发明专利