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原文传递线虫的鉴别方法及其应用

专利名称：	线虫的鉴别方法及其应用
摘要：	本发明提供了一种线虫的鉴别方法及其应用，涉及线虫鉴别领域。本发明的线虫的鉴别方法，包括以下步骤：收集线虫虫卵，所述线虫虫卵包括：捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵；通过观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、线虫虫卵的气室及外观形态和线虫虫卵能否与花生凝集素相结合，以将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。该方法操作简单，成本低，能够准确高效地将捻转血矛线虫虫卵与其他三种线虫区分开来，能够缓解动物体内捻转血矛线虫检测困难，检测成本高、操作复杂和捻转血矛线虫虫卵与其他线虫虫卵不易区分的技术问题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	四川省畜牧科学研究院
发明人：	叶勇刚;曹冶;李兴玉;肖璐;潘梦;廖党金;康润敏;魏勇;林毅;谢晶;叶建强;戴卓建;于吉峰
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-04-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910042825.2
公开号：	CN109682786A
代理机构：	北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	王术兰
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	610000 四川省成都市锦江区牛沙路7号
主权项：	1.一种线虫的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：收集线虫虫卵，所述线虫虫卵包括：捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵；通过观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、线虫虫卵的气室及外观形态和线虫虫卵能否与花生凝集素相结合，以将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。 2.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述收集线虫虫卵为采用沉淀法或漂浮法收集动物粪便中的线虫虫卵；优选采用沉淀法收集动物粪便中的线虫虫卵；优选地，所述沉淀法包括以下步骤：将粪便粉碎，于滤网上冲洗过滤得到滤液，然后将滤液再过滤2～3次，静置得到沉淀，将沉淀用水清洗后得到虫卵；优选地，所述滤网为40～120目，优选为60～100目；优选地，所述动物粪便取自动物直肠；优选地，所述动物粪便包括牛粪便和/或羊粪便。 3.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述观察为显微镜观察；优选地，所述显微镜的放大倍数为200～640倍，优选为400倍。 4.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述培养为将收集的线虫虫卵放置于生理盐水中培养3～4天，优选为4天；优选地，培养的温度为20～30℃，优选为25℃。 5.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量大于夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量；优选地，所述培养后的线虫虫卵中，有超过50％的捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵；有不超过0.1％的夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵；优选地，所述捻转血矛线虫虫卵含有气室的数量小于奥斯特线虫虫卵含有气室的数量；优选地，有不超过0.8％的捻转血矛线虫虫卵含有气室；有超过43％的奥斯特线虫虫卵含有气室。 6.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比大于捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比；优选地，所述奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的外观形态呈长椭圆形，奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.7～1.85，优选为1.74～1.83；所述捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的外观形态呈椭圆形，捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.45～1.6，优选为1.5～1.55；优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度和宽度小于夏伯特线虫虫卵的长度和宽度；优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度为64.22～102.2μm，优选为70～90μm；所述捻转血矛线虫虫卵的宽度为37.96～69.3μm，优选为40～60μm。 7.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述虫卵能否与花生凝集素相结合采用荧光法判断，包括以下步骤：将线虫虫卵依次进行水洗、PBS洗、染色和PBS洗，于荧光显微镜下观察；优选地，所述捻转血矛线虫虫卵能与花生凝集素相结合，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵不能与花生凝集素相结合。 8.根据权利要求7所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述水洗或PBS洗为将线虫虫卵与蒸馏水或PBS缓冲液混合后进行离心，去除上清液，得到虫卵沉淀；优选地，所述离心的离心力为250～300×g；优选地，所述离心的时间为4～6min；和/或，所述染色为采用荧光标记的花生凝集素染色；优选地，所述染色的时间为0.8～1h，优选为0.9～1h；和/或，所述染色和PBS洗之间还包括离心，去除上清液的步骤。 9.根据权利要求7或8所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述荧光显微镜使用的荧光封片液为甘油和PBS的混合液；优选地，所述荧光封片液中甘油与PBS的质量比为8～10:1；和/或，所述荧光显微镜的激发光为蓝色；优选地，所述荧光显微镜观察捻转血矛线虫虫卵呈绿色，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵未呈现绿色。 10.根据权利要求1-9任一项所述的线虫的鉴别方法在捻转血矛线虫与其他线虫鉴别中的应用。
所属类别：	发明专利