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原文传递一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法

专利名称：	一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法
摘要：	本发明公开了一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5‑羟甲基胞嘧啶的方法，本发明首先构建了检测5hmC的光电化学生物传感器，包括：电极，依次固定在电极表面的黑色TiO2、探针DNA、5hmC、对氨基苯硼酸、PAMAM和氨基修饰的氧化锌。本发明利用黑色TiO2的光电性能、糖基转移酶对5‑羟甲基胞嘧啶的专一性催化、PAMAM信号扩增作用以及ZnO的信号猝灭，实现对5‑羟甲基胞嘧啶的灵敏检测。本发明的检测方法操作简单，便于实现小型化，仅对ITO电极表面进行修饰就可以实现对5‑羟甲基胞嘧啶的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东农业大学
发明人：	殷焕顺;周云雷;艾仕云;隋程吉;陈燕;李菲
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910047559.2
公开号：	CN109709170A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	薛鹏喜
分类号：	G01N27/26(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	271018 山东省泰安市岱宗大街61号
主权项：	1.一种检测5hmC的光电化学生物传感器，其特征在于，包括：电极，依次固定在电极表面的黑色TiO2、探针DNA、含有5hmC的互补DNA链、氨基苯硼酸、PAMAM和氨基修饰的氧化锌；所述探针DNA与所述互补DNA链的碱基互补；优选的，所述电极为ITO电极；优选的，所述探针DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，探针DNA的3′端修饰有磷酸基团；优选的，所述含有5hmC的互补DNA链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 2.权利要求1所述的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)将电极进行预处理； (2)将黑色TiO2固定在步骤(1)处理后的电极表面； (3)将探针DNA固定在步骤(2)处理后的电极表面； (4)将5hmC固定于步骤(3)处理后的电极表面； (5)在糖基转移酶的催化作用下，将糖基引入到步骤(4)处理后的电极表面； (6)利用邻二羟基与氨基苯硼酸的反应，将对氨基苯硼酸修饰到步骤(5)处理后的电极表面； (7)利用氨基与羧基的反应，将PAMAM修饰到步骤(6)处理后的电极表面； (8)利用氨基与羧基的反应，将修饰氨基的ZnO固定到步骤(7)处理后的电极表面，即得到制备的生物传感器。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，电极预处理的方法为：将电极用乙醇-氢氧化钠混合液、丙酮和二次水分别超声清洗30-60min，晾干；优选的，所述乙醇-氢氧化钠混合液中，乙醇和氢氧化钠的质量比为1:1-1:4。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将黑色TiO2固定到预处理后的电极表面的方法为：将黑色TiO2加入到去离子水中，超声分散，制成黑色TiO2分散液，将黑色TiO2分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯照射下干燥；优选的，所述黑色TiO2与去离子水加入量的比为(10-20)mg:(3-10)mL；优选的，超声分散的时间为1-3h；优选的，所述黑色TiO2由如下方法制备而成：将白色TiO2和硼氢化钠按重量比为(0.5-2)：(0.5-2)研磨混匀，200-400℃氮气氛围下煅烧0.5-2h，得到黑色固体，洗涤、干燥，即得黑色TiO2。 5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将探针DNA固定在步骤(2)处理后的电极表面的方法为：将包含DNA探针的探针固定液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h；优选的，所述探针固定液中含有：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5M NaCl、1-5mMTCEP；pH 6.0-8.5。 6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将5hmC固定于步骤(3)处理后的电极表面的方法为：将10-40μL包含5hmC的DNA杂交液滴加到步骤(4)处理后的ITO电极表面，放入孵化箱中37℃潮湿条件下孵化1-4h；优选的，所述DNA杂交液中含有：3-15mM Tris-HCl、1-5mM EDTA、1-5M Na Cl；pH 6.0-8.5。 7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，将糖基引入到步骤(4)处理后的电极表面的方法为：将包含糖基转移酶的糖基转移酶反应液滴加到步骤(4)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h；优选的，所述糖基转移酶反应液中含有：3-15mM Tris-HCl、10-100mM NaCl、5-20mMMgCl2、0.5-4mM DTT；pH 6.0-8.5。 8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，将修饰氨基的ZnO固定到步骤(7)处理后的电极表面的方法为：将修饰氨基的ZnO分散液滴加到步骤(7)处理后的电极表面，于37℃潮湿条件下孵化1-4h；优选的，所述修饰氨基的ZnO由如下方法制备而成：将醋酸锌加入到无水乙醇中，搅拌均匀，在搅拌条件下加入NaOH溶液，于120-180℃条件下反应4-8h，得到第一产物；将第一产物洗涤，然后加入到NaOH溶液中，60-90℃搅拌回流反应15-25h，得到第二产物；将第二产物洗涤，然后加入到乙醇-水混合液中，在搅拌条件下加入APTES，回流10-25h，将反应产物洗涤、干燥，即得。 9.权利要求1所述的光电化学生物传感器在检测5hmC中的应用。 10.一种利用权利要求1所述的光电化学生物传感器检测5hmC的方法，其特征在于，包括以下步骤：以权利要求1所述的光电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行光电化学信号检测，含有0.01-1M AA的Tris-HCl缓冲溶液(pH为6.0-8.5)，建立电流与5hmC浓度之间的关系，对5hmC含量进行检测；优选的，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5-0.5V。优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-100mM。
所属类别：	发明专利