详情

原文传递检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法

专利名称：	检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法
摘要：	本发明检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法是使用高效液相色谱仪和FLD检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用高效液相色谱仪和FLD检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中齐拉西酮相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的齐拉西酮药物浓度，本发明血清经液液萃取并浓缩后进样，采用FLD检测器进行检测，检测方法具有低的检测限和高的专属性，更利于在临床治疗中对患者体内的齐拉西酮血药浓度进行监测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	张国成;雒琴;倪君君;贾永娟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910210541.X
公开号：	CN109725092A
代理机构：	北京双收知识产权代理有限公司
代理人：	解政文
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市大兴区经济技术开发区经海六路5号院东尚E园14号楼
主权项：	1.一种检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤： (一)标准溶液的标定 (a)标准工作液的配制：精确称取齐拉西酮标准品10mg置于10mL容量瓶中，用10mL甲醇进行溶解，得到标准储备液A，将标准储备液A用含40％-60％的甲醇水溶液进行稀释，分别在含有300-12800ng/mL齐拉西酮的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存； (b)内标工作液的配制：精确称取维拉帕米标准品10mg于10mL试管中，用10mL甲醇进行溶解，得到内标储备液B，将内标储备液B用含80％-100％的甲醇水溶液进行稀释，得到含有维拉帕米浓度为20ug/mL的内标工作液，并在-80℃条件下保存； (c)用标准溶液标定，得到标准曲线方程：用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度标准工作液与10μL内标工作液和190μL空白血清混合制成至少三种不同浓度的标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，加入1000μL甲基叔丁基醚的萃取剂，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀4-6min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液，分别移取900uL的上述上清液置于另一离心管中，在常温下用氮气缓慢吹干后，向吹干的离心管中分别加入100μL的含40％-60％甲醇水溶液的复溶液，进行溶解，再在转速10000-15000rpm下高速离心8-10min后，用高效液相色谱仪和FLD检测器对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的齐拉西酮色谱图和维拉帕米色谱图，以上述至少三个标准溶液的齐拉西酮峰面积与维拉帕米峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有齐拉西酮的浓度与内标工作液中含有维拉帕米浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝ax+b，并且得出权重系数a和b； (二)检测血液的离心取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于-20℃下冷冻保存至分析前备用； (三)待测样品处理 (d)用移液枪移取步骤(b)的内标工作液10uL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的200uL的血清于上述离心管中，在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀30s-1min；然后在上述离心管中加入1000μL甲基叔丁基醚的萃取剂，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀4-6min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液，取上述上清液900uL置于另一支1.5ml离心管中，在常温下，用氮气缓慢吹干后，向上述吹干的离心管中加入100μL含40％-60％甲醇水溶液的复溶液，再在转速10000-15000rpm下高速离心8-10min后，得到上清液即为待测样品； (四)待测样品的检测移取步骤(d)待测样品90uL，使用高效液相色谱仪和FLD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的齐拉西酮色谱图和维拉帕米色谱图，将上述色谱图中的齐拉西酮峰面积和维拉帕米峰面积之比y代入上述步骤(一)的标准曲线方程y＝ax+b中，通过计算得到待检测样品中齐拉西酮浓度与内标工作液中维拉帕米浓度之比x，标内标工作液中维拉帕米浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的齐拉西酮药物浓度。 2.如权利要求1所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有300、400、800、1600、3200、6400和12800ng/mL浓度的齐拉西酮溶液。 3.如权利要求2所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：所述萃取过程中涡旋采用的转速为2000rpm。 4.如权利要求3所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：所述复溶液是由1∶1的水和甲醇组成的复溶液。 5.如权利要求4所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：在步骤(a)和(b)中的稀释液分别是含有50％甲醇水溶液和100％甲醇。 6.如权利要求5所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的分析色谱柱为Waters，Atlantis○R dC18，所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M，高效液相色谱仪设置的柱温为40℃，进样量为30uL。 7.如权利要求6所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相为含有50∶50比例的乙腈∶水溶液，其中水溶液为含有10mM乙酸铵、0.1％三乙胺和0.02％甲酸的水溶液，分析色谱柱流速为0.3mL/min，分析色谱柱采用等度洗脱方式。 8.如权利要求7所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：所述FLD检测器的激发波长为231nm，发射波长为420nm。 9.如权利要求8所述的检测血液中齐拉西酮含量的液相色谱分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
所属类别：	发明专利