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原文传递一种病原微生物快速检测方法

专利名称：	一种病原微生物快速检测方法
摘要：	本发明提供了一种病原微生物快速检测方法，包括如下的步骤：在双功能化Au@超薄Pt纳米材料表面修饰上待测病原微生物抗体，获得检测探针；在羧基化磁珠表面偶联修饰上所述待测病原微生物抗体，获得捕获探针；将待测样品依次与捕获探针和检测探针孵育后，获得类似三明治的夹心产物，所得产物在酸性条件下与TMB、H2O2混合，检测混合液在1608cm‑1处拉曼峰的强度变化值，根据定量分析标准工作曲线计算出待测样品浓度。本方法的构建过程和检测过程快速简单，且采用Au@超薄Pt纳米材料和羧基化磁珠对TMB进行协同催化，不仅成本大大降低、而且灵敏度大大提高，适合病原微生物在基层和现场的快速、高灵敏检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉市农业科学院
发明人：	王利华;朱运峰;吴文辉;胡姣;肖康飞;白向茹;战艺芳
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201811470932.7
公开号：	CN109765361A
代理机构：	武汉河山金堂专利事务所(普通合伙)
代理人：	胡清堂
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430076 湖北省武汉市洪山区白沙洲大道青菱乡张家湾特1号
主权项：	1.一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤： S1、在Au@超薄Pt纳米材料表面修饰上待测病原微生物抗体，所得产物记为检测探针； S2、筛选获得磁学性能优良、同时具有一定模拟酶活性的羧基化磁珠，在所述羧基化磁珠表面，通过EDC活化偶联的方式修饰上S1所述的待测病原微生物抗体，所得产物记为捕获探针； S3、将S2所述捕获探针与一系列已知浓度的病原微生物样品孵育，磁分离洗涤，重悬，再加入S1所述检测探针孵育，磁分离洗涤后将获得的夹心产物重悬处理； S4、将S3所得产物在酸性条件下与TMB、H2O2混合，构成催化反应体系，反应1-2min，取部分混合液滴至锡箔纸上进行拉曼测试，以病原微生物浓度的对数为横坐标，以对应的1608cm-1处拉曼峰的强度变化值为纵坐标，绘制定量分析标准工作曲线； S5、将待测未知浓度病原微生物样品依次与捕获探针和检测探针孵育后，所得产物在酸性条件下与TMB、H2O2混合，检测混合液在1608cm-1处拉曼峰的强度变化值，根据定量分析标准工作曲线计算出样品中待测病原微生物的浓度。 2.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，S1所述检测探针的制备方法为：将Au@超薄Pt纳米材料加入PB溶液中，然后再加入病原微生物抗体，混匀后，室温静置或温和振荡30-60min；然后再加入聚乙二醇溶液，混匀；室温静置20-30min后，离心处理，重悬。 3.根据权利要求1或2所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，所述Au@超薄Pt纳米材料同时具有拉曼活性和模拟酶催化活性，呈规则球形，粒径为30-80nm。 4.根据权利要求1、2或3所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，所述Au@超薄Pt纳米材料的制备方法为：采用晶种增长法合成纳米金，然后通过蠕动泵缓慢加样的方式，在其表面包裹上铂层。 5.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，S2所述捕获探针的制备方法为：在羧基化磁珠中加入EDC溶液，快速振荡10-30min，继续加入病原微生物抗体，快速振荡2-4h，然后加入BSA溶液，快速振荡30-60min，离心洗涤，将获得的捕获探针重悬，冰箱4℃保存备用。 6.根据权利要求1或5所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，所述羧基化磁珠粒径为100-400nm。 7.根据权利要求1、2或5所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于：所述病原微生物为沙门氏菌。 8.根据权利要求1、2或5所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于：所述重悬溶液和洗涤溶液均为0.01M PB。 9.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，S4所述催化反应体系为10μL BR、20μL夹心产物、4.0μL 5mM TMB、1.0μL 2M H2O2，所述BR的pH为4.0-5.0。 10.根据权利要求1所述的一种病原微生物快速检测的方法，其特征在于，所述拉曼测试的条件为：激光波长为785nm，曝光时间为20s，平均测量3-5次。
所属类别：	发明专利