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原文传递一种六神丸HPLC指纹图谱检测方法

专利名称：	一种六神丸HPLC指纹图谱检测方法
摘要：	本发明公开了一种六神丸HPLC指纹图谱检测方法，该方法包括：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，建立六神丸对照图谱及指纹图谱。六神丸指纹图谱与标准指纹图谱对比，相似度均大于0.9。本发明提供的六神丸指纹图谱检测方法，灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确的评价六神丸质量，对保证六神丸临床疗效具有重要意义。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	雷允上药业集团有限公司
发明人：	李全;翟云良;楼坚伟;潘耀宗;罗年翠;戴晶晶;狄留庆;王恒斌;严燕青;李俊松;辛艳;李小冬
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910126362.8
公开号：	CN109765319A
代理机构：	南京经纬专利商标代理有限公司
代理人：	杨海军
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	215009 江苏省苏州市高新区横山路86号
主权项：	1.一种六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1)供试品溶液的制备：精密称取六神丸粉末，加入甲醇溶液作为提取溶剂，密塞，称重，超声或加热回流提取，放冷，准确称重，用甲醇溶液补足失重，吸取上清液，得六神丸供试品溶液； (2)对照品溶液的制备：取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品中的一种或几种，精密称定，加甲醇溶解，得对照品溶液； (3)六神丸HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取步骤(1)对照品溶液和步骤(2)供试品溶液，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，建立六神丸HPLC对照图谱及指纹图谱。高效液相色谱仪测定的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速0.8～1.2mL/min；柱温35℃～40℃；进样量10μL～20μL；高效液相色谱仪的检测器为UV检测器、ELSD检测器中的一种或两种串联合用；UV检测波长为192nm、204nm、296nm中的一种；ELSD检测参数：增益150～200，喷雾器为冷却模式，漂移管温度50℃～100℃，气体压力25psi～50psi。 2.根据权利要求1所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(1)供试品溶液的制备：精密称取六神丸粉末0.2g，加入10mL的体积浓度75％甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，功率250W，频率40kHz下超声处理30min，放冷，准确称重，用体积浓度75％甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得六神丸供试品溶液；步骤(2)对照品溶液的制备：取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、42.96、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82、362.33、54.02、46.67μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸混合对照品溶液；步骤(3)六神丸HPLC指纹图谱的测定：所述的色谱条件为：色谱柱为Kromasil C18柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)、Xbridge C18柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)或ODS-2柱(规格为250mm×4.6mm，5μm)中的一种；流动相：乙腈为A相-0.15％的磷酸水溶液、0.5％的磷酸水溶液或0.05％三氟乙酸水溶液中的一种为B相，梯度洗脱：0～80min，乙腈A相由6％→80％；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；高效液相色谱仪的检测器为UV检测器、ELSD检测器中的一种或两种串联合用；UV检测波长为192nm、204nm、296nm中的一种；ELSD检测参数：增益150，喷雾器为冷却模式，漂移管温度70℃，气体压力25psi。 3.根据权利要求1所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-0.5％磷酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV检测器，检测波长204nm。所用的梯度洗脱条件为：时间(min) 乙腈A(％) 0.5％磷酸水(％) 0～3 6 94 3～6 6→10 94→90 6～11 10 90 11～20 10→20 90→80 20～35 20→25 80→75 35～45 25→30 75→70 45～55 30 70 55～80 30→40 70→60 80～85 40 60 85～90 40→90 60→10 90～95 90 10 95～100 90→6 6→94 100～105 6 94 4.根据权利要求1所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-0.05％三氟乙酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV和ELSD检测器串联，检测波长296nm；ELSD参数为：增益150，喷雾器为冷却模式，漂移管温度70℃，气体压力25psi。所用的梯度洗脱条件为： 5.根据权利要求1或2所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的六神丸指纹图谱包括HPLC-UV指纹图谱和HPLC-ELSD指纹图谱。 6.权利要求1至5任一项所述的六神丸指纹图谱检测方法，其特征在于，六神丸HPLC-UV指纹图谱在204nm共有19个共有峰，其中以16号峰蟾毒灵为参照峰，通过比对分析，共有峰中12号峰来自于牛黄，1、2、3、5、6、7、8、9、11、13、14、15、16、18、19号峰来源于蟾酥，4、10、17号峰来自于麝香；其中6号峰为蟾蜍它灵、8号峰为沙蟾毒精、11号峰为远华蟾毒精、13号峰为蟾毒它灵、15号峰为华蟾毒它灵、18号峰为脂蟾毒配基、19号峰为华蟾酥毒基。 7.权利要求1至5任一项所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，六神丸HPLC-UV指纹图谱在296nm共有14个共有峰，其中以13号峰蟾毒灵为参照峰，通过比对分析，14个共有峰均来源于蟾酥药材，其中3号峰为和蟾蜍他灵，5号峰为沙蟾毒精，9号峰为远华蟾毒精，11号峰为蟾毒它灵，12号峰为华蟾毒它灵。 8.权利要求1至5任一项所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，六神丸HPLC-ELSD指纹图谱共有13个共有峰，其中9’号峰胆酸为参照峰，通过比对分析，共有峰中5’、9’、10’、12’、13’号峰来源于牛黄，1’、2’、3’、4’、6’、7’、8’、11’号峰来源于蟾酥，9’号峰也来源于麝香；其中3’号峰为和蟾蜍他灵，6’号峰为远华蟾毒精，7’号峰为蟾毒它灵，8’号峰为蟾毒灵，12’号峰为鹅去氧胆酸，13’号峰为去氧胆酸。 9.根据权利要求1所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(3)将六神丸供试品HPLC指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行评价，相似度均大于0.9。 10.根据权利要求1所述的六神丸HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，其处方原料药材蟾酥的HPLC指纹图谱的构建方法包括以下步骤： (1)供试品溶液的制备：精密称取蟾酥药材粉末0.2g，加入10mL体积浓度75％甲醇作为提取溶剂，密塞，称重，功率250W，频率40kHz下超声处理30min，放冷，准确称重，用体积浓度75％甲醇补足失重，吸取上清液，使其过0.22μm的微孔滤膜，得蟾酥药材供试品溶液； (2)对照品溶液的制备：精密称取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，震荡摇匀，得到质量浓度分别为24.14、19.79、52.66、42.96、49.43、81.13、54.38、139.19、136.82μg/mL的和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基混合对照品溶液； (3)蟾酥药材HPLC指纹图谱的测定：分别精密吸取步骤(1)对照品溶液和步骤(2)供试品溶液，用高效液相色谱仪测定，以参照峰保留时间和峰面积为1，计算供试品相对保留时间和相对峰面积，建立蟾酥药材HPLC对照图谱及指纹图谱；步骤(3)高效液相色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱；流动相：乙腈为A相-0.5％磷酸水溶液为B相，梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测器为UV检测器，检测波长204nm；梯度洗脱条件为：时间(min) 乙腈A(％) 0.5％磷酸水(％) 0～3 6 94 3～6 6→10 94→90 6～11 10 90 11～20 10→20 90→80 20～35 20→25 80→75 35～45 25→30 75→70 45～55 30 70 55～80 30→40 70→60 80～85 40 60 85～90 40→90 60→10 90～95 90 10 95～100 90→6 6→94 100～105 6 94
所属类别：	发明专利