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原文传递基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法及比率型检测细胞内ATP的方法

专利名称：	基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法及比率型检测细胞内ATP的方法
摘要：	本申请公开了基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法及其比率型检测细胞内ATP的方法，构建方法包括三个步骤，分别是硅纳米粒子‑甲基丙烯酸(MAA)‑DNA 1结构的构建；甲基丙烯酸(MAA)‑DNA 2结构的构建；DNA‑硅纳米水凝胶的合成；检测细胞内ATP的方法包括两个步骤：包括细胞培养和细胞成像。本发明使用二氧化硅纳米粒子，建立了一种DNA‑硅纳米水凝胶。不同于一般的金属纳米粒子，二氧化硅纳米粒子具有良好的生物相容性，及稳定性，使得DNA‑硅纳米水凝胶具有更低的毒性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	青岛科技大学
发明人：	丁彩凤;王晶;纪小婷;王俊宁
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910088438.2
公开号：	CN109781688A
代理机构：	北京志霖恒远知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	杨玉廷
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	266000 山东省青岛市市北区郑州路53号
主权项：	1.基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法，其特征是：包括硅纳米粒子-甲基丙烯酸-DNA 1结构的构建、甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建和DNA-硅纳米水凝胶的合成，所述硅纳米粒子-甲基丙烯酸(MAA)-DNA 1结构的构建： S1、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的活化：取23.5μL 1×10-5M的DNA 1加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 1进行活化，活化时间为30min，同时取21μL 1.17×10-4M的甲基丙烯酸置于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对甲基丙烯酸活化30min，取10μL硅纳米粒子于离心管中，加入10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺活化30min； S2、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的链接：将S1中活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 1链在试管中混合，摇晃3min，然后放置在4℃环境中，反应12h，得到产物A，将产物A加入到S1中已经活化好的硅纳米粒子中继续反应，放置在4℃环境中，反应12h，得到产物Ⅰ；所述甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建； S3、DNA 2链及甲基丙烯酸的活化：取52.15μL 1×10-5M的DNA 2加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 2进行活化，活化时间为30min，同时取4.01μL1.17×10-2M的甲基丙烯酸于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行活化，活化30min； S4、DNA 2链及甲基丙烯酸的链接：将活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 2链混合，放置在4℃环境中，反应12h，得到产物Ⅱ，备用；所述DNA-硅纳米水凝胶的合成； S5、将所得产物Ⅱ加入10μL 1％的Irgacure2959，100μL的缓冲溶液和346.5μL的去离子水，混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min，得到产物Ⅲ，备用； S6、将所得产物Ⅱ加入4μL 1％的Irgacure2959，20μL的缓冲溶液和119.85μL的去离子水，混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min，得到产物Ⅳ，备用； S7、将所得产物Ⅲ、产物Ⅳ和1×10-5M的Linker按照比例加入，放入95℃的水浴锅中退火5min后，放入冰水浴中反应2-4h。 2.根据权利要求1所述的一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法，其特征是：所述缓冲溶液为100mM Tris-HCl 500mM NaCl 100mM MgCl2。 3.根据权利要求1所述的一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法，其特征是：所述S7中的产物Ⅲ、产物Ⅳ和Linker的比例为100:19.58:4.7。 4.一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的比率型检测细胞内ATP的方法，其特征是：包括细胞培养和细胞成像，所述细胞培养为在细胞培养皿中加入血清浓度为10％的1640细胞培养液进行细胞培养，将制备好的DNA-硅纳米水凝胶加入到培养皿中，充分混匀后，置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中，培养1-5h。所述细胞成像包括以下两个步骤： A1、取出培养1-5h后的细胞培养皿，倒掉混合培养液，再向培养皿中加入1640培养液，重复冲洗，最后，加入1mL含有10％血清的培养液,待用， A2、在激光共聚焦显微镜下观察细胞内FAM和Cy3的荧光，以488nm为激发光源，采集520nm与565nm的发射光，明显观测到：细胞中有较强的Cy3红色荧光，随着时间的推移，可以清楚看到红色荧光越来越弱，绿色荧光越来越强，表明此DNA-硅纳米水凝胶具有良好的检测ATP的效果。
所属类别：	发明专利