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原文传递一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法

专利名称：	一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法
摘要：	本申请提供一种基于DNA碳点‑硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，该方法包括DNA碳点‑硅纳米水凝胶的制备和DNA碳点‑硅纳米水凝胶荧光检测癌胚抗原，DNA碳点‑硅纳米水凝胶的制备包括荧光碳点的制备、SiNPs‑CD‑DNA的制备、DNA与甲基丙烯酸的结合、聚甲基丙烯酸(MAA)‑DNA复合物的合成、DNA碳点‑硅纳米水凝胶的合成。本申请构建的DNA碳点‑硅纳米水凝胶所需反应条件简便，构造时间短，而且利用其检测血清中的CEA，具有检测范围宽、检测灵敏度高、检测选择性好的优点，能更加准确的检测出血清样本中的CEA含量，为肿瘤病人病灶的早期诊断提供帮助。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	青岛科技大学
发明人：	纪小婷;吕浩源;丁彩凤
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910207899.7
公开号：	CN110108876A
代理机构：	天津市鼎拓知识产权代理有限公司
代理人：	刘雪娜
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	266000 山东省青岛市市北区郑州路53号
主权项：	1.一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤： (一)DNA碳点-硅纳米水凝胶的制备 (1)荧光碳点的制备 S1、称取0.6g尿素和0.3g柠檬酸于烧杯中，加10mL去离子水使粉末完全溶解，在800W微波加热4min，放入60℃的真空干燥箱干燥1h。称取干粉质量。将黑色粉末放入40mL去离子水中，3000rpm离心20min，去除滤渣，收集上清液，即碳点原液； (2)SiNPs-CD-DNA的制备 S2、取20μL上述反应清液，稀释至500μL，在12500rpm离心20min，收集上清液，即碳点基液，备用； S3、在上述碳点基液中，加入20μL 10-5M的引发DNA链和2mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，混匀仪混匀后室温活化15min，即得活化液一；同时，取5.5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入表面氨基修饰的二氧化硅纳米颗粒溶液中，混匀仪混匀后室温活化15min，即得活化液二，将两份溶液混合，室温条件下于摇床中混匀反应2h后，放入4℃冰箱中继续反应12h，即得二氧化硅纳米颗粒-碳点-引发DNA链复合物(SiNPs-CD-DNA)； (3)DNA与甲基丙烯酸的结合 S4、取20μL 10-5M的包含CEA适体结构的DNA(HA)与10μL 0.55mg/mL的NHS溶液混合，混匀后活化30min，即得HA活化液。同时，将17μL 2×10-10M的甲基丙烯酸溶液与10μL 0.2mg/mL的EDC溶液混合，混匀后反应活化30min，即得甲基丙烯酸活化液一。室温条件下，将HA活化液和甲基丙烯酸活化液一于室温下混合，放入摇床，在室温条件下反应2h后，放入冰箱4℃环境下继续反应12h，形成甲基丙烯酸-DNA1复合物(PA)； S5、取20μL 10-5M的DNA(HB)与10μL 0.55mg/mL的NHS混合，混匀后反应活化30min，既得HB活化液。同时，将17μL 2×10-8M的甲基丙烯酸与10μL 0.2mg/mL的EDC溶液混合，混匀后反应活化30min，既得甲基丙烯酸活化液二。室温条件下，将HB活化液和甲基丙烯酸活化液二混合，放入摇床，于室温下反应2h后，放入冰箱4℃环境下继续反应12h，形成甲基丙烯酸-DNA2复合物(PB)； (4)聚甲基丙烯酸-DNA复合物的合成 S6、将步骤(3)得到的甲基丙烯酸-DNA1复合物(PA)和甲基丙烯酸-DNA2复合物(PB)中分别加入70μL浓度为1％的光引发剂12959，再加入57μL HEPES缓冲液，将甲基丙烯酸-DNA1复合物(PA)和甲基丙烯酸-DNA2复合物(PB)两份溶液放入紫外灯下光照反应19min，形成聚甲基丙烯酸-DNA复合物； (5)DNA碳点-硅纳米水凝胶的合成 S7、将步骤(4)得到的聚甲基丙烯酸-DNA1复合物(PA)和聚甲基丙烯酸-DNA2复合物(PB)两份溶液放入95℃水浴中加热5min后，迅速转入0℃冰水中，使溶液温度迅速降温待用； S8、上述冷却后的两份溶液与步骤(2)产生的二氧化硅纳米颗粒-碳点-引发DNA链复合物(SiNPs-CD-DNA)溶液充分混匀，加入117μL HEPES缓冲液，室温摇床中反应12h，即形成DNA碳点-硅纳米水凝胶； (二)血清中CEA的荧光强度检测向步骤(5)生成的DNA碳点-硅纳米水凝胶中加入含CEA的血清，然后放入摇床反应2-3h，最后用分子荧光仪测定其荧光强度,得到荧光强度值。 2.如权利要求1所述的一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，其特征在于，所述步骤(2)二氧化硅纳米颗粒、碳点和引发DNA链的结合中，引发DNA链序列为TTT TTT AGC TGA ACG ATA CCA,所述引发DNA链5′端修饰羧基。 3.如权利要求2所述的一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，其特征在于，所述步骤(3)DNA与甲基丙烯酸的结合中，具有CEA适体结构的DNA(HA)结构序列为TTT TTT CCA CGA TAC CAG CTT ATT CAA TTC GTG GGA TGT CTG GTA TCG TTCAGC T，所述含CEA适体结构的DNA(HA)链3′端修饰氨基，5′端修饰亚甲基蓝。 4.如权利要求3所述的一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，其特征在于，所述步骤(3)DNA与甲基丙烯酸的结合中，所述DNA(HB)结构序列为CCACGA ATT GAA CAA GAG CTG AAC GAT ACC ACT ATT GCT TAT TCA ATA TTT TT,所述DNA(HB)5′端修饰氨基。 5.如权利要求4所述的一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，其特征在于，所述步骤(4)和步骤(5)中，所用到的HEPES缓冲液PH为7.2，且含有0.15mol/L MgCl2和0.15mol/L NaCl。 6.如权利要求5所述的一种基于DNA碳点-硅纳米水凝胶材料荧光检测血清中癌胚抗原的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所用的紫外灯的波长为365nm。
所属类别：	发明专利