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原文传递基于碳量子点的荧光免疫分析方法

专利名称：	基于碳量子点的荧光免疫分析方法
摘要：	本发明提供基于碳量子点的荧光免疫分析方法。所述碳量子点是以柠檬酸为碳源，硫脲或尿素为氮源制备得到的。将所述碳量子点应用于酶联免疫分析方法中，建立一种基于碳量子点的高灵敏度的荧光免疫分析新方法，利用碳量子点与酶催化的显色底物间产生高效的荧光内滤效应，可以成功地将酶联免疫分析中辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶催化底物反应形成的吸光度信号有效地转化为荧光信号。该方法具有操作简单、成本低、灵敏度高和稳定性好等优点，可用于小分子半抗原的定量检测。另外，该方法具有良好扩展性，有望扩宽至其它目标检测体系。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国农业大学
发明人：	沈建忠;王战辉;温凯;江海洋;董保磊;段长飞;于雪芝;史为民
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201811612977.3
公开号：	CN109781976A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;黄爽
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100193 北京市海淀区圆明园西路2号
主权项：	1.荧光碳量子点，其特征在于，所述荧光碳量子点按如下方案I或II制备得到：方案I：将3-5g柠檬酸和5-7g硫脲加入到15-20mL水中，搅拌使化合物溶解，将混合液置于微波反应器中，800-1000W功率下加热7-10min，直至溶液从无色变为深棕色固体，然后冷却至室温，加入25mL水溶解，所得碳量子点溶液经过滤、透析及色谱柱纯化，即得；方案II：将3-5g柠檬酸和5-7g尿素加入到15mL水中，搅拌使化合物溶解，将混合液置于微波反应器中，800-1000W功率下加热7-10min，直至溶液从无色变为深棕色固体，然后冷却至室温，加入25mL水溶解，所得碳量子点溶液经过滤、透析及色谱柱纯化，即得。 2.根据权利要求1所述的荧光碳量子点，其特征在于，所述荧光碳量子点按如下方案I′或II′制备得到：方案I′：将5g柠檬酸和7g硫脲加入到15mL水中，搅拌使化合物溶解，将混合液置于微波反应器中，800W功率下加热7分钟，直至溶液从无色变为深棕色固体，然后冷却至室温，加入25mL水溶解，所得碳量子点溶液经过滤、透析及色谱柱纯化，即得；方案II′：将3g柠檬酸和5g尿素加入到15mL水中，搅拌使化合物溶解，将混合液置于微波反应器中，800W功率下加热7分钟，直至溶液从无色变为深棕色固体，然后冷却至室温，加入25mL水溶解，所得碳量子点溶液经过滤、透析及色谱柱纯化，即得。 3.根据权利要求1所述的荧光碳量子点，其特征在于，所述过滤采用0.22μm膜过滤；和/或所述透析使用型号为3500Da的透析膜在超纯水中透析至少24h；和/或所述色谱柱为Sephadex G25柱。 4.根据权利要求1-3任一项所述的荧光碳量子点，其特征在于，方案I制备的荧光碳量子点的激发波长为370-380nm，发射波长为520-530nm，优选激发波长为370nm，发射波长为520nm；方案II制备的荧光碳量子点的激发波长为400-410nm，发射波长为515-525nm，优选激发波长为400nm，发射波长为515nm。 5.权利要求1-4任一项所述荧光碳量子点的以下任一应用： ①制备生物探针、生物传感器以及催化领域中的应用； ②在免疫分析中的应用。 6.基于碳量子点的荧光免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、用人工抗原包被酶标板的各反应孔； S2、向反应孔中加入特异性抗体和待测样品溶液，孵育一段时间后，向反应孔中加入孔辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗，继续孵育； S3、向反应孔中加入辣根过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液或碱性磷酸酶底物4-硝基苯磷酸二钠溶液，进行显色反应； S4、显色反应结束后，向反应孔中加入权利要求1-4任一项所述荧光碳量子点，检测荧光强度； S5、配制不同浓度的小分子半抗原标准品溶液，按照S2-S4进行检测，建立反映荧光强度与小分子半抗原浓度之间关系的标准曲线； S6、根据待测样品溶液的检测结果，对照标准曲线，获得待测样品溶液中小分子半抗原的浓度。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)用包被液将人工抗原稀释到浓度3.3×10–5mg/mL，按100μL/孔加入96孔酶标板中，4℃孵育12h后，以洗涤液洗板； 2)按150μL/孔加入封闭液进行封闭，37℃孵育1h，以洗涤液洗板； 3)按50μL/孔加入浓度2.5×10–5mg/mL的特异性抗体和按50μL/孔加入待测样品溶液，37℃孵育0.5h，抗原-抗体发生特异性结合反应，再以洗涤液洗板； 4)按100μL/孔加入浓度0.1mg/mL的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育0.5h，形成酶标记免疫复合物，以洗涤液洗板； 5)按100μL/孔将浓度2.5mM的辣根过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液或浓度5mM的碱性磷酸酶底物4-硝基苯磷酸二钠溶液分别加入相应的酶标板孔中，37℃孵育20min； 6)按20μL/孔加入20μg/mL的碳量子点溶液，并用多功能酶标仪检测荧光值； 7)配制不同浓度梯度的小分子半抗原标准品溶液，按照3)-6)进行检测，处理所得数据，绘制标准曲线； 8)根据待测样品溶液的检测结果，对照标准曲线，获得待测样品溶液中小分子半抗原的浓度；其中，所述包被液为：10mM、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为：含0.05％Tween-20的50mM、pH 7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为：含2％BSA的磷酸盐缓冲液。 8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述小分子半抗原来自真菌毒素、农药、兽药或环境激素，优选金刚烷胺、黄曲霉毒素B1或利巴韦林。 9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述人工抗原为所述小分子半抗原与牛血清白蛋白的偶联物；和/或所述特异性抗体为抗所述小分子半抗原的单克隆抗体。 10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，当所述小分子半抗原为金刚烷胺、黄曲霉毒素B1或利巴韦林时，相应的线性检测范围及最低检测限分别如下：金刚烷胺的线性检测范围：0.035-1.1ng/mL，最低检测限：0.02ng/mL；黄曲霉毒素B1的线性检测范围：0.016-0.95ng/mL，最低检测限：0.012ng/mL；利巴韦林的线性检测范围：0.18-0.74ng/mL，最低检测限：0.015ng/mL。
所属类别：	发明专利