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原文传递采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法

专利名称：	采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法
摘要：	本发明公开了采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，所述方法包括以下步骤：S1：采集乳腺癌患者的外周血，并将外周血中的乳腺癌循环肿瘤细胞进行分离，得到乳腺癌循环肿瘤细胞；S2：对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在；S3：对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养扩增；S4：将培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞制成检测切片；S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。本发明方法操作简单，检测准确度高，可以避免假阴性等情况，提高对乳腺癌的排查准确度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	贵州;52
申请人：	贵州省人民医院
发明人：	侯净;魏娜;朱海振;戴民;陈欢;陆婧
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910151700.3
公开号：	CN109781988A
代理机构：	北京栈桥知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	潘卫锋
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	550002 贵州省贵阳市南明区中山东路83号
主权项：	1.一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： S1：采集乳腺癌患者的外周血，并将外周血中的乳腺癌循环肿瘤细胞进行分离，得到乳腺癌循环肿瘤细胞； S2：对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验，检验其是否存在； S3：若存在，对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养扩增；若不存在，重复步骤S1～S2； S4：将培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞制成检测切片； S5：检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。 2.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述步骤S1中具体为：采集乳腺癌症患者外周血8～10ml，并将采集的血样与裂解液按照1：(5～8)混合，混合均匀后升温至23～28℃并加入占其体积百分比为2.5％的戊二醛，保温1～2分钟后，以2～3℃的速度降温至15～17℃，降温期间滴加占其体积百分比为1.5％的谷氨酸钠，并静置2～3min，用PBS液洗涤离心得到乳腺癌循环肿瘤细胞。 3.根据权利要求2所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述裂解液为红细胞裂解液，且内含有占其体积百分比为0.5％的甘草酸二甲。 4.根据权利要求2所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述采集乳腺癌症患者外周血与红细胞裂解液按照1：(5～8)混合。 5.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述步骤S2中具体为： (1)将乳腺癌循环肿瘤细胞的样本进行离心去上清，然后加入温度为38.5℃的0.09mol/L KCl溶液12～15mL，振荡混匀后以0.5℃/min降温至36.5℃静置15～20min； (2)加入3ml的戊二醛和0.7ml的羟甲基纤维素钠，离心吸去上清液，加入适量丙烯醛，制成浓度适中的悬浊细胞液； (3)吸取4～6μL悬浊细胞液滴至防脱载玻片上，老化处理后，依次向玻片加入封闭液和穿孔剂，多次漂洗直至干净，将玻片脱水后自然干燥； (4)将CEA抗原和C-MET探针混合液在24℃±0.5℃下自然混合，待混合均匀后进行离心，取8μL滴在杂交区域，并迅速盖上盖玻片，将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育； (5)取出孵育后的玻片，将玻片置于56～61℃的PBS液中振荡5～8s脱去盖玻片，然后以3℃/min速度降温至28～33℃，取出玻片，以35℃的蒸馏水冲洗3～5次，每次2min，然后置于暗处自然干燥玻片； (6)滴加8uL复染剂，并在荧光显微镜下观察玻片，若CEA未被染色，且非巨大裸核可以判断为乳腺癌循环肿瘤细胞。 6.根据权利要求5所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述杂交孵育的条件为：65℃变性50s后快速升温至72℃保持2min，随后以5℃/min降温至36℃孵育50～85min。 7.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：将乳腺癌循环肿瘤细胞悬浮于含有5～15％FBS的培养液中，然后置于CO2细胞培养箱中进行培养两个阶段培养，一阶段为培养温度在23～28℃下培养4～6h后，加入纳米磁性小球并继续培养8～10h，以0.5℃/h降温至18～21℃后进入二阶段培养，二阶段为每隔12～16h更换一次培养液，并每间隔20～30min施加4～5T的恒定磁场5～10min，培养液更换3～4次后得到培养扩增细胞，再将其加入秋水仙素，培养1～2h，形成培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞。 8.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述步骤S4具体为：收集培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞，依次经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片，制成检测切片。 9.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法，其特征在于，所述步骤S5具体为： 1)将检测切片脱蜡、水化，使用去离子水冲洗3～5次直到各溶液冲净，将检测切片置于磷酸盐缓冲液700～900ml中，180KPa压强下蒸煮3～5min，冷却至室温，使用去离子水冲洗2～3次；再使用含有2.6％H2O2的蒸馏水浸泡检测切片8min，使用PBS液冲洗2～3次； 2)首先滴加HER2单抗，36.8℃下静置2～3h然后迅速降温至10℃静置0.5～1h，使用PBS液冲洗2～3次；继续滴加SPG-抗体多聚体，在常温下静置15min，使用PBS液冲洗2～3次；去除PBS残留液，在显微镜观察下在切片上滴加DAB溶液至显色； 3)依次经过蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片；阅片检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。
所属类别：	发明专利