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原文传递心脏标志物的荧光微球联合检测装置及其制备方法

专利名称：	心脏标志物的荧光微球联合检测装置及其制备方法
摘要：	本发明涉及一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置及其制备方法，属于医疗检测设备领域。样品垫、免疫荧光抗体玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸收垫分别粘贴在塑料板上，硝酸纤维素膜的两端分别与吸收垫、免疫荧光抗体玻璃纤维膜搭接，免疫荧光抗体玻璃纤维膜的另一端与样品垫搭接，硝酸纤维素膜上设置固相有高特异性MPO抗体的第一检测线T1、固相有高特异性cTnI抗体的第二检测线T2、固相有高特异性NT‑proBNP抗体的第三检测线T3、固相有高特异性D二聚体抗体的第四检测线T4和质控线C；质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。优点是有效的提高了反应的灵敏度，特异性，同样的阈值下，还可降低免疫微球的用量，节约成本，操作简便，实用性强。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	吉林双正生物工程有限公司
发明人：	王珺楠;杨小军;李欣;赵旻
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-06T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201910109522.8
公开号：	CN109799334A
代理机构：	吉林长春新纪元专利代理有限责任公司
代理人：	魏征骥
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	130000 吉林省长春市北湖科技开发区盛北大街3333号
主权项：	1.一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置，其特征在于：样品垫、免疫荧光抗体玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸收垫分别粘贴在塑料板上，所述硝酸纤维素膜的两端分别与吸收垫、免疫荧光抗体玻璃纤维膜搭接，所述免疫荧光抗体玻璃纤维膜的另一端与样品垫搭接；所述硝酸纤维素膜上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有高特异性MPO抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性cTnI抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性NT-proBNP抗体，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体。 2.根据权利要求1所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上还设置第四检测线T4，所述的第四检测线T4上固相有高特异性D二聚体抗体。 3.如权利要求1所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：包括下列步骤： (a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到试管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)于微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时；将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件8000～14000r/min、15～25min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀； (b)免疫荧光微球分别交联MPO抗体、cTnI抗体和NT-proBNP抗体，分别取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边分别滴加MPO抗体、cTnI抗体和NT-proBNP抗体，加入抗体后，反应1～1.5min后，再到超声波上超声25～35秒，然后再反应1～1.5小时，加牛血清白蛋白BSA分别进行封闭1～1.5小时，将封闭好的微球分别进行离心，速度为8000～14000r/min,15～20min，将缓冲液分别加入到离心后的免疫荧光微球中，使各微球分散均匀，待用； (c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球获得免疫荧光微球溶液，用各免疫荧光微球溶液分别喷涂于玻璃纤维垫，或将各免疫荧光微球溶液混合后喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光抗体玻璃纤维膜； (d)将硝酸纤维素膜用聚乙烯醇处理液预处理后，喷点与石墨纳米颗粒结合的MPO抗体、cTnI抗体和NT-proBNP抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，各检测线喷点量1ul/cm，制得硝酸纤维素膜； (e)将预处理的样品垫1、步骤(c)制备的免疫荧光抗体玻璃纤维膜、步骤(d)制备的硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。 4.如权利要求3所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)、(c)所述的缓冲液由Tris-HCL液、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，海藻糖浓度为5％，牛血清白蛋白BSA浓度为1％。 5.如权利要求3所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(d)与石墨纳米颗粒结合的MPO抗体、cTnI抗体和NT-proBNP抗体的制备方法是：以石墨作为载体，取200μL、浓度1mg/mL石墨纳米颗粒溶液分别和25μL、浓度40μmol/L的MPO抗体、cTnI抗体和NT-proBNP抗体溶液加入到超纯水中，使最终反应体系1mL，充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200～300r/m条件下，分别将上述各混合溶液在摇床内避光震荡培养2～3h，反应后的混合溶液用超速离心机在12000～13000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤3～4次，分别去除上清液中过量的未反应的MPO抗体、cTnI抗体和NT-proBNP抗体，所得沉淀物分别为石墨MPO抗体探针复合物、石墨cTnI抗体探针复合物和石墨NT-proBNP抗体探针复合物，分别用超纯水将其定容至1mL，并在4℃条件储存。 6.如权利要求3所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(d)中的聚乙烯醇处理液由聚乙烯醇与Triton X-100混合后稀释到浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。 7.如权利要求3所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(e)中的预处理的样品垫采用样品垫处理液200ul/cm，所述样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、表面活性剂Tween-80组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为1％，表面活性剂浓度为1％。 8.如权利要求2所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置，其特征在于：包括下列步骤： (a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到试管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)于微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时；将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件8000～14000r/min、15～25min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀； (b)免疫荧光微球分别交联MPO抗体、cTnI抗体、NT-proBNP抗体和D二聚体抗体，分别取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边分别滴加MPO抗体、cTnI抗体、NT-proBNP抗体和D二聚体抗体，加入抗体后，反应1～1.5min后，再到超声波上超声25～35秒，然后再反应1～1.5小时，加牛血清白蛋白BSA进行封闭1～1.5小时，将封闭好的微球分别进行离心，速度为8000～14000r/min,15～20min，将缓冲液分别加入到离心后的免疫荧光微球中，使各微球分散均匀，待用； (c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球获得免疫荧光微球溶液，用各免疫荧光微球溶液分别喷涂于玻璃纤维垫，或将各免疫荧光微球溶液混合后喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光抗体玻璃纤维膜； (d)将硝酸纤维素膜用聚乙烯醇处理液预处理后，喷点与石墨纳米颗粒结合的MPO抗体、cTnI抗体、NT-proBNP抗体和D二聚体抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，各检测线喷点量1ul/cm，制得硝酸纤维素膜； (e)将预处理的样品垫1、步骤(c)制备的免疫荧光抗体玻璃纤维膜、步骤(d)制备的硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。 9.如权利要求8所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)、(c)所述的缓冲液由Tris-HCL液、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，海藻糖浓度为5％，牛血清白蛋白BSA浓度为1％。 10.如权利要求8所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(d)与石墨纳米颗粒结合的MPO抗体、cTnI抗体、NT-proBNP抗体和D二聚体抗体的制备方法是：以石墨作为载体，取200μL、浓度1mg/mL石墨纳米颗粒溶液分别和25μL、浓度40μmol/L的MPO抗体、cTnI抗体、NT-proBNP和D二聚体抗体抗体溶液加入到超纯水中，使最终反应体系1mL，充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200～300r/m条件下，分别将上述各混合溶液在摇床内避光震荡培养2～3h，反应后的混合溶液用超速离心机在12000～13000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤3～4次，分别去除上清液中过量的未反应的MPO抗体、cTnI抗体、NT-proBNP抗体和D二聚体抗体，所得沉淀物分别为石墨MPO抗体探针复合物、石墨cTnI抗体探针复合物、石墨NT-proBNP抗体探针复合物和石墨D二聚体抗体探针复合物，分别用超纯水将其定容至1mL，并在4℃条件储存。 11.如权利要求8所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(d)中的聚乙烯醇处理液由聚乙烯醇与Triton X-100混合后稀释到浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。 12.如权利要求8所述的一种心脏标志物的荧光微球联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(e)中的预处理的样品垫采用样品垫处理液200ul/cm，所述样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、表面活性剂Tween-80组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为1％，表面活性剂浓度为1％。
所属类别：	发明专利