详情

原文传递蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用

专利名称：	蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用
摘要：	本发明公开了一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用。该方法是利用正向‑反向同位素标记的定量方法结合蛋白热稳定变化测量技术，其能够通过观测细胞内部哪些蛋白在药物的包裹下发生热力学变化，全局性地鉴定与药物相互作用的靶标蛋白。本发明的方法克服了传统鉴定方法的假阳性率高的缺点，其具有高通量、高深度、高精度、检测范围广，耗时短的特点，打破现有技术在药物靶标鉴定方面的局限性，为药物靶标研究提供有力的支撑。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	暨南大学
发明人：	何庆瑜;汪洋;张静;梁钧泽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201910043053.4
公开号：	CN109799350A
代理机构：	广州市华学知识产权代理有限公司
代理人：	刘瑜
分类号：	G01N33/58(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510632 广东省广州市天河区黄埔大道西601号
主权项：	1.一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)SILAC标记：分别用含有重链同位素和轻链同位素标记的氨基酸的细胞培养液对细胞进行培养，并进行传代，得到重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞； (2)细胞裂解：分别将步骤(1)中重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞进行裂解，得到重链同位素标记的蛋白裂解液和轻链同位素标记的蛋白裂解液；然后将重链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液A1、A2、A3……An，B1、B2、B3……Bn，同时将轻链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，D1、D2、D3……Dn；其中，n为正整数，且n≥3； (3)正向-反向实验：正向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液A1、A2、A3……An中，依次得到蛋白裂解液A1′、A2′、A3′……An′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液B1、B2、B3……Bn中，依次得到蛋白裂解液B1′、B2′、B3′……Bn′；反向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，依次得到蛋白裂解液C1′、C2′、C3′……Cn′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液D1、D2、D3……Dn中，依次得到蛋白裂解液D1′、D2′、D3′……Dn′； (4)酶解和质谱检测：将步骤(3)中得到的蛋白裂解液A1′、B1′和C1′、D1′放入温度1中进行处理，将A2′、B2′和C2′、D2′放入温度2中进行处理，将A3′、B3′、C3′和D3′放入温度3中进行处理，以此类推，将An′、Bn′、Cn′和Dn′放入温度n中进行处理，待处理结束后分别离心，得到蛋白A1″、A2″、A3″……An″，B1″、B2″、B3″……Bn″，C1″、C2″、C3″……Cn″，D1″、D2″、D3″……Dn″；然后将蛋白A1″与B1″、A2″与B2″、A3″与B3″……An″与Bn″分别进行等体积混合，依次得到混合液E1、E2、E3……En，同时，将C1″与D1″、C2″与D2″、C3″与D3″……Cn″与Dn″分别进行等体积混合，依次得到混合液F1、F2、F3……Fn；再向混合液E1、E2、E3……En，以及F1、F2、F3……Fn中加入蛋白酶进行消化，得到蛋白消化液E1′、E2′、E3′……En′，以及F1′、F2′、F3′……Fn′；最后对其分别进行质谱鉴定，依次得到蛋白定量结果G1、G2、G3……Gn，以及H1、H2、H3……Hn；其中，温度n>温度3>温度2>温度1； (5)结果判断：分别计算蛋白定量结果G2、G3……Gn与G1的比值，得到R1、R2……Rn-1，同时，分别计算蛋白定量结果H2、H3……Hn与H1的比值，得到R1′、R2′……Rn-1′；若Rn-1……>R2>R1>1，且Rn-1′……R2′>R1′>1，则该蛋白为所述小分子药物的靶标蛋白。 2.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的温度1的温度范围为40℃～60℃；步骤(4)中所述的温度2的温度范围为40℃～60℃；步骤(4)中所述的温度3的温度范围为40℃～60℃；步骤(4)中所述的温度n的温度范围为40℃～60℃。 3.根据权利要求2所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的温度1的温度范围为45℃～55℃；步骤(4)中所述的温度2的温度范围为45℃～55℃；步骤(4)中所述的温度3的温度范围为45℃～55℃；步骤(4)中所述的温度n的温度范围为45℃～55℃。 4.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的n的取值为3；步骤(4)中所述的温度1的温度范围为45℃；步骤(4)中所述的温度2的温度范围为50℃；步骤(4)中所述的温度3的温度范围为55℃。 5.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的重链同位素标记的氨基酸为Arg10和Lys8；步骤(1)中所述的轻链同位素标记的氨基酸为Arg0和Lys0。 6.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的细胞为癌细胞；步骤(3)中所述的小分子药物为p38MAPK抑制剂；步骤(3)中所述的药物载体为用于溶解小分子药物的溶剂。 7.根据权利要求6所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的细胞为肺腺癌细胞；步骤(3)中所述的小分子药物为p38MAPK抑制剂SB202190；步骤(3)中所述的药物载体为二甲基亚砜和水中的至少一种。 8.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的小分子药物的浓度为10mM；步骤(3)中所述的蛋白裂解液A1、A2、A3……An与小分子药物的体积比均为1000：1；步骤(3)中所述的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn与小分子药物的体积比均为1000：1；步骤(3)中所述的蛋白裂解液B1、B2、B3……Bn与药物载体的体积比均为1000：1；步骤(3)中所述的蛋白裂解液D1、D2、D3……Dn与药物载体的体积比均为1000：1；步骤(4)中所述的混合液E1、E2、E3……En与蛋白酶的质量比均为40：1；步骤(4)中所述的混合液F1、F2、F3……Fn与蛋白酶的质量比均为40：1。 9.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的传代的次数为7代以上；步骤(2)中所述的裂解为采用蛋白裂解液进行裂解；步骤(2)中所述的重链同位素标记的蛋白裂解液的蛋白浓度为5u/μL；步骤(2)中所述的轻链同位素标记的蛋白裂解液的蛋白浓度为5u/μL；步骤(4)中所述的处理的时间均为3～5min；步骤(4)中所述的蛋白酶为胰酶。 10.权利要求1～9任一项所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法在筛选药物靶标中的应用。
所属类别：	发明专利