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原文传递基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒

专利名称：	基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒
摘要：	本发明公开一种基于铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒。本发明利用鱼精蛋白（protamine，pro）既作为铂纳米单元的稳定剂，又是胰蛋白酶的的水解底物。Pro‑铂纳米单元模拟氧化酶催化溶液中氧气氧化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺显色，提供了一种快速、简便、灵敏的胰蛋白酶检测新方法。该检测新方法所用的Pro‑铂纳米单元模拟氧化酶制备简便易得，可以实现对血清中的胰蛋白酶进行可视化分析，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福建医科大学
发明人：	林丽清;林晓昀;赵成飞;吴丽娜;林新华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910111834.2
公开号：	CN109813666A
代理机构：	福州智理专利代理有限公司
代理人：	王义星
分类号：	G01N21/31(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	350004 福建省福州市台江区交通路88号
主权项：	1.一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是将胰蛋白酶和pro-铂纳米单元模拟氧化酶加入到醋酸盐缓冲液中，在40 ℃下温浴10 min后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺获得显色产物，目视观察颜色变化或测定紫外-可见吸收；所述的pro-铂纳米单元模拟氧化酶由以下步骤制得: 将800μl浓度为16 mmol/L 氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中,在室温下将800μl浓度为5 mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀；两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸；随后, 混合物在室温下不断搅拌2小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。 2.根据权利要求1所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是将100 μL pro-铂纳米单元和不同浓度的胰蛋白酶标准溶液加入到200 μL浓度为10mmol/L、pH=8的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺加入到750μL醋酸盐缓冲液中；在40℃下温浴10 min后获得显色产物，目视观察颜色变化或在652 nm处测定紫外-可见吸收度。 3.根据权利要求1或2所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是显色产物溶液颜色为蓝色，随着胰蛋白酶浓度的增大，溶液颜色变化值越大，目视观察溶液颜色的检测限为0.6 μg/mL。 4.根据权利要求1或2所述的基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测方法，其特征是显色产物最大吸收波长为652 nm，根据652 nm波长处测得的吸光度作标准曲线，其检测的线性范围为0.06μg/mL~0.6μg/mL，检测限为0.03 μg/mL。 5.一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒，其特征是试剂盒中包括a 液、b液、标准液和缓冲液，所述a液中含有pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液，b液中含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，标准液为胰蛋白酶标准溶液。 6.根据权利要求5所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒，其特征是a液中含有浓度为0.30 mmol/L的pro-铂纳米单元模拟氧化酶溶液; b液中含有用50 mmol/L，pH=4.5的醋酸盐缓冲液配制的浓度为16mmol/L的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液; 标准液包括浓度为0.06、0.12、0.18、0.32、0.36、0.42、0.54、0.6 μg/mL的胰蛋白酶溶液; 缓冲液包括50 mmol/L、pH=4.5的醋酸盐缓冲液和10 mM、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液。 7.根据权利要求5或6所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒，其特征是所述的pro-铂纳米单元模拟氧化酶由以下步骤制得的：将800μl浓度为16mmol/L 氯铂酸溶液加入40毫升超纯水中,在室温下将800μl浓度为5 mg/mL鱼精蛋白溶液加入搅拌混匀；两分钟后，在30秒内滴入400μl浓度为50mm硼氢化钠用于还原氯铂酸；随后,混合物在室温下不断搅拌2小时；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤24小时，并水洗3次，得到鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液，将鱼精蛋白稳定-铂纳米单元水溶液冷冻干燥得到pro-铂纳米单元模拟氧化酶粉末。 8.权利要求5-7任一所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是作为胰蛋白酶检测。 9.根据权利要求8所述的一种基于pro-铂纳米单元模拟氧化酶的胰蛋白酶检测试剂盒的应用，其特征是将100μL的a液和10μL不同浓度的胰蛋白酶标准液分别加入到200 μL浓度为10 mmol/L的pH=8.0的Tris-HCl中，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中；在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定吸光度，绘制胰蛋白酶标准曲线或计算回归方程；取20μL不同浓度人血清样品加入到200 μL浓度为10 mmol/L的pH=8.0的Tris−HCl缓冲液，加入100 μL的a液，在37℃中孵育2小时；之后3000 rpm离心5 min，取200μL上清液和50μL的b液加入到750μL醋酸盐缓冲液中，在40℃下温浴10 min后，在652 nm处测定紫外-可见吸收度，结果如表1所示，计算血清样品中胰蛋白酶的含量和样品的加标回收率。
所属类别：	发明专利