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原文传递基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法

专利名称：	基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法
摘要：	本发明涉及基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，包括首先对细胞的培养和刺激，接着进行多色免疫表型标记，再用流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞经结核特异性抗原ESAT‑6和CFP‑10刺激后，其细胞表型CD25+CD134+的表达增加。本发明的方法有着操作简单的优点，且还增加了诊断的灵敏度和缩短了检测时间，适合在结核病的检测中推广。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江省人民医院
发明人：	周永列;赵慈余;张富杰;夏骏;胡庆丰
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910083672.6
公开号：	CN109813903A
代理机构：	北京中济纬天专利代理有限公司
代理人：	陈振华
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310006 浙江省杭州市下城区上塘路158号
主权项：	1.基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)细胞培养：设三管；第一管为阴性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.4～0.6mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为9～11ug/mL和CD28、CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.4～0.6mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT-6、CFP-10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT-6和CFP-10浓度各为4.5～5.5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为0.9～1ug/mL后，再加入0.4～0.6mL肝素抗凝的外周血；把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入36～38℃、4～6％CO2培养箱中培养20～24小时； 2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取45～55uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD3-APC、CD4-PC5、CD25-PerCP、CD134-FITC各4～6uL，常温避光15～20min；加NH4Cl溶血素400～450ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4-CD3设门，取CD4+CD3+细胞分析CD25+CD134+群细胞百分率，测定结果为测定管的CD25+CD134+群细胞百分率－阴性对照管的CD25+CD134+群细胞百分率。 2.基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)细胞培养：设三管；第一管为阴性对照管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.5mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为10ug/mL和CD28、CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.5mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT-6、CFP-10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT-6和CFP-10浓度各为5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.5mL肝素抗凝的外周血；把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入37℃、5％CO2培养箱中培养24小时； 2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取50uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD3-APC、CD4-PC5、CD25-PerCP、CD134-FITC各5uL，常温避光15min；加NH4Cl溶血素400ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4-CD3设门，取CD4+CD3+细胞分析CD25+CD134+群细胞百分率，测定结果为测定管的CD25+CD134+群细胞百分率－阴性对照管的CD25+CD134+群细胞百分率。 3.根据权利要求2所述的基于流式细胞术检测结核特异性T细胞免疫表型用于诊断结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所设的三管中，含10％小牛血清的1640细胞培养基的用量为0.5mL。
所属类别：	发明专利