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原文传递一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法

专利名称：	一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法
摘要：	一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，属于食品检测技术领域。本发明首先配置苯扎贝特和环丙贝特标准品溶液和制备茶叶样品；对薄层板进行预洗，随后进行HPTLC点样；通过HPTLC分离使原本混在一起的目标物按分子结构的差异移动到薄层板上不同的位置形成物理隔离；随后，通过浸渍方式与薄层板耦合的发光菌株可以方便地实现对样品中多元目标的同时检测。本发明建立了一种快速定量茶叶中降血脂化学药的高效薄层色谱和生物发光法联用的检测方法，具有经济、快速、简便的优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江南大学
发明人：	陈益胜;舒蓝萍;王了;徐学明;张煌;黄彩虹;金征宇;谢正军;柏玉香
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910287919.6
公开号：	CN109828076A
代理机构：	无锡市大为专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	时旭丹;张仕婷
分类号：	G01N30/90(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品学院食品组分与物性实验室
主权项：	1.一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于步骤为：配置苯扎贝特和环丙贝特标准品溶液，制备茶叶样品；对薄层板进行预洗，随后进行HPTLC点样；通过HPTLC分离使原本混在一起的目标物按分子结构的差异移动到薄层板上不同的位置形成物理隔离；随后，通过浸渍方式使与薄层板耦合的发光菌株方便地实现对样品中多元目标的同时检测。 2.根据权利要求1所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于具体步骤如下：（1）标准溶液配制：用电子天平分别精确称量10mg的苯扎贝特和10mg的环丙贝特标准品，分别置于10mL容量瓶，甲醇定容，得到浓度为1mg/mL的标准储备液；将标准储备液平时避光静置在4℃环境，待临近分析工作开始，取出0.2 mL置于10 mL容量瓶，甲醇定容稀释，得到浓度为0.02 mg/mL的标准工作溶液；标准工作溶液随用随配；（2）分别制备茶叶样品溶液：取荷叶、罗布麻、银杏叶样品先分别用电动粉碎机均匀粉碎，再称取1.0g粉碎样品加入10 mL甲醇，25℃超声水浴萃取30min，取出后5000r/min离心5min；离心后取上层5mL清液装入注射器，压缩压杆使之通过0.45μm尼龙滤膜，由此制得的样品清液直接用于HPTLC点样；（3）HPTLC点样和色谱条件：首先用100μL点样针手动吸取样品溶液，通过半自动薄层点样仪在0.5MPa氮气流的协助下吹扫到距离薄层板底端10 cm的位置，液流吹扫速度100μL/s，预排体积0.2μL，条带宽度6mm，距离两侧边缘至少15mm；对由步骤（1）、（2）制备的每个样品进行点样，一个样品点样结束后手动取出点样针，用甲醇清洗三次后，进行下一个样品点样；全部样品点样结束后，取出薄层板，用电吹风加热1 min，目的是使附着在点样位置的残留甲醇挥发；色谱分离在全自动薄层展开仪中进行，流动相配比乙酸乙酯/甲醇体积比为9/1，展开距离60 mm；色谱分离条件：通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度，持续3 min，调节相对湿度至35%，薄层板预平衡10 min；待流动相前沿到达预定高度，系统自动结束，将薄层板取出，放在薄层加热器上80℃烘烤5min，以便获得明亮、低噪音的生物发光成像背景；（4）生物发光成像检测：使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液，浸渍速度1mm/s，停留时间2s，随后将浸有工作发光悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测，成像曝光时间40s，间距2min，连续拍摄15张；（5）分析：将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。 3.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于工作发光悬浮液的制备过程如下：（1）模拟海水液体配制：按照以下配方配制模拟海水液体培养基：30g/L NaCl，5g/L Na2HPO4，5g/L KH2PO4，3mL/L甘油，5g/L蛋白胨和5g/L酵母提取物，加入1 L超纯水搅拌溶解；用1mol/L的氢氧化钠溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.3-7.7，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min，配制好的液体培养基封装置于冰箱中冷藏备用，不用时在4℃环境下可保存7天；（2）发光菌株的培养和保藏：将用甘油冷冻保藏的发光细菌接种到盛有步骤（1）制备的100mL液体培养基的三角瓶中；瓶口用灭菌的四层折叠锡箔纸包裹瓶口，确保培养过程中外界氧气能够进入瓶中，在25℃环境中100r/min摇瓶培养，得到细菌母液；然后在成熟的细菌母液中加入等体积的新鲜液体培养基，制得工作发光悬浮液；工作发光悬浮液不用时，可在4℃环境中保存3天。 4.根据权利要求3所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（2）所述发光菌株使用琼脂平板法进行保藏，具体如下： a、发光菌株培养液的制备：取10g琼脂，30g NaCl，5g Na2HPO4，5g KH2PO4, 3mL甘油, 5g蛋白胨和5g酵母提取物，加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养液pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min；待灭菌后的培养液冷却到60℃，趁热在直径10cm的培养皿中倒平板； b、接种：首先将灭菌后的接种环浸入成熟的发光菌株培养液中，然后在营养琼脂表面划斜线，反复多次；接种后的营养琼脂置于25℃环境避光培养48 h，待观察到明显菌落后，得到细菌母液，转移到-4℃环境避光保藏。 5.根据权利要求3所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（2）中，将所用培养基对600nm入射光的吸收度作为测定菌体密度的指标；以新鲜模拟海水液体培养基清液为参比，培养过程中用分光光度计监测培养液对600 nm入射光的吸光度OD600，选取OD600数值达到0.7时培养液作为细菌母液。 6.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（3）所述薄层板需要进行预洗；具体步骤如下：首先将10mL甲醇倒入洁净展开缸中，放入空白薄层板，使其展开到顶端，为使杂质尽可能被清洗干净，薄层板展开至顶端后需保持5min，取出后将薄层板放在薄层板加热器上100℃烘干5min，挥发残留有机溶剂，烘干后的薄层板用铝箔纸包裹备用。 7.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：所述薄层板的薄层材料是普通硅胶。 8.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（5）具体过程如下：通过生物发光成像仪拍摄的照片保存为CPF，Black/white linear格式，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。 9.根据权利要求1所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：所述发光菌株具体为在正常生理条件下能够发射可见光的一类微生物。
所属类别：	发明专利