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原文传递一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用

专利名称：	一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用
摘要：	本发明涉及一种交联肽段富集方法及其在蛋白质相互作用研究中的应用。使用两侧具有反应活性基团且连接臂上含有邻二羟基基团的交联剂将细胞内蛋白质复合体进行交联并酶解，随后采用硼亲和材料对交联肽段进行选择性富集和高效释放。该方法具有操作简便、高效、高通量、高可信度的优点并应用于蛋白质相互作用的分析。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	张丽华;方菲;赵群;安雨馨;杨开广;张玉奎
专利状态：	有效
申请日期：	2017-11-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-04T00:00:00+0800
申请号：	CN201711226826.X
公开号：	CN109839303A
代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：	马驰
分类号：	G01N1/40(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
主权项：	1.一种用于交联肽段富集的方法，其特征在于：使用连接臂上含有邻二羟基基团的交联剂对细胞或提取的蛋白质样品进行交联，将交联蛋白质样品进行酶解后，采用硼亲和材料选择性富集交联肽段，从而获取蛋白质结构及蛋白质相互作用信息；具体包括： (1)对于细胞样品，使用缓冲液冲洗去除培养液并使细胞悬浮；对于已提取出的蛋白样品，使用水或缓冲液配制成溶液；对于交联剂，使用水、缓冲液或有机溶剂配制成溶液； (2)将交联剂溶液加入至细胞样品溶液或蛋白样品溶液中进行反应； (3)对于细胞样品，离心弃去反应体系中的反应液，然后对细胞样品进行裂解，得交联蛋白样品；对于蛋白样品，向反应体系中加入反应终止液，或通过透析、滤膜或凝胶去除反应液，得交联蛋白样品； (4)采用pH为1-6.5的酸性缓冲溶液或pH为7.5-14的碱性缓冲溶液配制的溶有表面活性剂或有机溶剂的溶解液来溶解交联蛋白样品，加入还原剂，高温孵育，同时进行蛋白质样品的变性及还原； (5)加入烷基化试剂对变性及还原后的蛋白质样品进行烷基化反应后，向蛋白质样品中加入蛋白酶溶液进行酶解，并将酶解产物进行除盐并冻干； (6)向步骤(5)的产物中加入带有硼亲和基团的富集材料； (7)使用洗脱液洗去富集材料上非特异性吸附的肽段； (8)使用酸性溶液将富集材料上键合的肽段释放出来，除盐，冻干并重溶，进行质谱分析和数据检索。 2.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(1)中所述的缓冲液为pH为7.1-10的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上，且不含能与所用交联剂上反应基团反应的基团；步骤(1)中所述的细胞样品，为胰酶消化或细胞刮消化得到的活细胞样品；步骤(1)中所述的蛋白样品，为单一蛋白样品或二种以上蛋白的混合蛋白样品，配制的蛋白质量与溶液的体积比为1μg/mL-100mg/mL；步骤(1)中所述的交联剂，为两侧含有与蛋白反应的基团，且连接臂上含有化学断裂基团的交联剂，配制的交联剂浓度为1μM-1M；步骤(1)中所述的有机溶剂，为乙腈、有机醇类、有机酸类、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中的一种或二种以上。 3.按照权利要求1或2所述的预处理方法，其特征在于：所述的交联剂为两侧具有与蛋白上氨基反应的活性基团的化学物，活性基团为琥珀酰亚胺基团、卤代芳烃基团、亚胺酸酯基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上巯基反应的活性基团的化学物，活性基团为马来酰亚胺基团、2-巯基吡啶基团、硫代磺酸基团、卤代乙酰基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上羧基反应的活性基团的化学物，活性基团为碳二亚胺基团、异氰酸基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上糖链反应的活性基团的化学物，活性基团为酰肼基团、氨基基团中的一种或二种；或为两侧具有与蛋白上任意基团反应的活性基团的化学物，活性基团为苯基叠氮基团、双吖丙啶基团中的一种或二种；所述的交联剂，其两侧活性反应基团分别为上述任一反应基团；所述的交联剂，其连接臂上的化学富集基团，为邻二羟基基团。 4.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(2)中所述的反应体系中细胞浓度为106-109个/mL，蛋白终浓度为1nM-1mM，交联剂的终浓度为10nM-100mM；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h。 5.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(3)中所述的反应终止液为具有能与交联剂两侧反应基团反应的基团的物质；所述的反应条件为15-40℃反应10min-2h或0-10℃反应10min-10h。 6.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(3)中所述的细胞裂解方法为机械裂解或高温孵育法等裂解方法中的一种或二种以上；上述机械裂解方法，具体为在蛋白质提取液与生物样本的混合物中加入蛋白酶抑制剂后，使用匀浆器、超声仪、研钵或组织捣碎机等对组织或细胞样品进行裂解；上述蛋白酶抑制剂为下列物质中的一种或二种以上：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、抑肽酶、抑氨肽酶、焦磷酸钠、反-环氧丁二酰基-L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷、乙二胺四乙酸二钠、亮抑蛋白酶肽或胃酶抑素A、本甲磺酰基氟化物中的一种或二种以上；上述物质中每种蛋白酶抑制剂在蛋白质提取液中的浓度范围分别在1-200mg/mL之间；上述高温孵育法，具体为将蛋白质提取液与生物样本的混合物在40-100℃水浴下孵育1-60min。 7.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(4)中所述的蛋白质样品溶解液中，pH为1-6.5的酸性缓冲溶液，为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；所述的pH为7.5-14的碱性缓冲缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液中的一种或二种以上；所述的蛋白质溶解液中，所述的表面活性剂包括： 1)十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、烷基糖苷、100(聚乙二醇辛基苯基醚)(Triton X-100)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、RapiGest SF或乙基苯基聚乙二醇(NP-40d)中的一种或二种以上，质量体积浓度按表面活性剂的质量(以g为单位)与缓冲溶液的体积(以mL为单位)之比计为0.1％-30％； 2)阳离子部分为烷基链部分含2个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子中的一种或二种以上；阴离子部分为卤素离子、NO3-、ClO4-、AlCl4-、BF4-、PF4-、CF3COO-、CF3SO3-、(CF3SO2)2N-或SbF6-中的一种或二种以上的离子液体；质量体积浓度按离子液体的质量(以g为单位)与碱性缓冲溶液的体积(以mL为单位)之比计为0.1％-30％； 3)尿素、硫脲或盐酸胍等去垢剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按去垢剂的物质的量与缓冲溶液的体积之比计为0.1-20M；所述的有机溶剂为有机醇类或有机酸类中的一种或二种以上，体积浓度按有机溶剂与缓冲溶液的体积之比计为0.1％-100％。所述的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或β-巯基乙醇等还原剂中的一种或二种以上，摩尔浓度按还原剂的物质的量与碱性缓冲溶液的体积之比计为0.1-1000mM。所述的高温孵育法，具体为将蛋白质提取液与生物样本的混合物在40-100℃水浴下孵育1min-10h。 8.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(5)中所述的烷基化试剂为碘代乙酸或碘乙酰胺中的一种或二种，溶于上述碱性缓冲溶液后的摩尔浓度为1-200mM；所述的蛋白酶为胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C/N、蛋白内切酶Glu-C/N、Asp-C/N中的一种或二种以上，使用二种以上时，选用的酶可同时使用或顺序使用，蛋白酶与蛋白质的质量比为1:500–500:1。 9.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(6)中所述的硼亲和基团的单体为2-羧基苯硼酸、5-羧基-2-羟甲基苯硼酸、4-甲酰基苯硼酸、氨基苯硼酸或5-氨基-2-羟甲基苯硼酸等中的一种或二种以上；所述富集材料的基质为琼脂糖凝胶球、硅球、聚合物球等有机/无机材料；步骤(7)中所述的洗脱液为下述中的一种：浓度为0.1-8M的氯化钠溶液、0.1-8M的氯化钾溶液、0.1-1M的碳酸钠溶液、2-10M的尿素溶液、1-8M的盐酸胍溶液或10-1000mM的碳酸氢铵溶液；乙腈、甲醇、异丙醇；十二烷基磺酸钠、Triton X-100、Chaps、Tween；步骤(8)中所述的交联肽段释放溶液为pH为1-6.5的酸性溶液，酸性溶液为为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液中的一种或二种以上。 10.按照权利要求1所述的预处理方法，用于机体信号通路及蛋白质结构解析领域中蛋白质相互作用研究的应用。
所属类别：	发明专利