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原文传递一种测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器及其制备方法与应用

专利名称：	一种测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器及其制备方法与应用
摘要：	本发明公开了一种测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器及其制备方法与应用，包括磁性ECL探针Fe3O4@SiO2/AuNPs/WS2‑Aptamer，以及循环肿瘤细胞抗体进行表面结合的基底电极，所述基底电极表面采用Nafion/AuNPs/Ru(bpy)32+溶液进行修饰。利用WS2量子点作为Ru(bpy)32+电致化学发光共反应剂信号放大的三明治型ECL免疫传感器，用于循环肿瘤细胞的定量分析，具有优异的抗干扰性能和较高的选择性，既不需要常规检测方法中对样品进行复杂处理，也避免了使用流式细胞仪等常规检测方法费用高、操作繁琐等问题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	东南大学
发明人：	沈艳飞;潘登;吉格儿;薛怀佳;张越;张袁健
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-04T00:00:00+0800
申请号：	CN201910089120.6
公开号：	CN109839501A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	肖明芳
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	211106 江苏省南京市江宁区东南大学路2号
主权项：	1.一种测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，包括磁性ECL探针Fe3O4@SiO2/AuNPs/WS2-Aptamer，以及循环肿瘤细胞抗体进行表面结合的基底电极，所述基底电极表面采用Nafion/AuNPs/Ru(bpy)32+溶液进行修饰。 2.根据权利要求1所述的测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，所述磁性ECL探针Fe3O4@SiO2/AuNPs/WS2-Aptamer采用如下方法制备： (1)称取氯化铁和柠檬酸三钠加入到乙二醇中，放于磁力搅拌器上搅拌溶解，随后在搅拌状态下向其中加入适量乙酸钠，待完全溶解，搅拌10～50min，转入高温高压反应釜中于100～250℃，反应2～24h，待反应完成后取出冷却至室温，离心分离清洗，得到Fe3O4纳米粒子； (2)将制备好的Fe3O4纳米粒子溶解到乙醇水溶液中，向其中加入适量甲醛溶液和间苯二酚，在10～60℃下机械搅拌2～20h，然后升温至10～200℃获得f-Fe3O4复合纳米材料；取适量上述制备的材料溶解在含有十六烷基三甲基溴化铵的氨水溶液中，10～60min内滴加入正硅酸乙酯，在4～60℃下机械搅拌2～20h，获得Fe3O4@SiO2；用3-氨丙基三乙氧基硅烷对其氨基化后加入适量纳米金溶液，4～60℃下搅拌1～20h，得到Fe3O4@SiO2/AuNPs复合材料； (3)将上述复合材料加入到浓度为0.1～10mg/ml的二硫化钨量子点溶液中，4～60℃下搅拌1～20h，得到Fe3O4@SiO2/AuNPs/WS2； (4)先用EDC/NHS对Fe3O4@SiO2/AuNPs/WS2进行活化处理，再将细胞适体溶液加入其中，黑暗条件下于4～60℃搅拌反应1～20h，然后加入BSA溶液室温搅拌反应1～5h，离心并重悬于PBS溶液中得到Fe3O4@SiO2/AuNPs/WS2-Aptamer溶液。 3.根据权利要求2所述的测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤(1)中，所述氯化铁、柠檬酸三钠和乙酸钠的质量比为(1:1:1)～(4:1:10)。 4.根据权利要求2所述的测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤(2)中，所述Fe3O4纳米粒子、甲醛、间苯二酚的质量比为(1:1:1)～(4:1:10)；所述f-Fe3O4、十六烷基三甲基溴化铵、正硅酸乙酯使用量比例为(1g:5g:1mL)～(1g:5g:5mL)；所述Fe3O4@SiO2、APTES和AuNPs混合质量比为(1:1:1)～(1:1:3)。 5.根据权利要求2所述的测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤(3)中，所述Fe3O4@SiO2/AuNPs复合材料与二硫化钨量子点溶液混合质量比为(1:1)～(1:20)。 6.根据权利要求2所述的测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，步骤(4)中，EDC、NHS和AuNPs的质量比为4:2:1～2:1:2。 7.根据权利要求1所述的测定循环肿瘤细胞的电致化学发光免疫传感器，其特征在于，所述基底电极采用如下方法进行修饰和表面抗体结合： (1)将AuNPs分散在0.1～2vt％Nafion溶液中并搅拌0.2～3h，得到Nafion/AuNPs溶液； (2)将Nafion/AuNPs溶液滴加到预处理过的基底电极表面，室温放置2h，用PBS溶液清洗，晾干；得到的电极浸泡在浓度为0.1-10mM Ru(bpy)32+溶液中，室温放置0.1～5h，然后用PBS溶液清洗，晾干； (3)将循环肿瘤细胞抗体溶液滴加在步骤(2)得到的电极表面，1～10℃放置12h，然后用PBS溶液清洗，晾干； (4)向步骤(3)得到的电极表面滴加BSA溶液，室温放置1～5h，然后用PBS溶液清洗，晾干即得。 8.权利要求1所述的电致化学发光免疫传感器用于测定循环肿瘤细胞的应用。 9.权利要求1所述的电致化学发光免疫传感器用于测定循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)将磁性ECL探针Fe3O4@SiO2/AuNPs/WS2-Aptamer溶液加入含有循环肿瘤细胞的溶液中，10-50℃捕捉10-100min，磁性分离并重悬成细胞悬液； (2)将表面结合有循环肿瘤细胞抗体的基底电极浸泡在步骤(1)得到得细胞悬液中进行特异性反应，20～50℃反应10～60min，然后用PBS溶液清洗，晾干； (3)将步骤(2)得到的电极放在含有PBS的溶液中进行ECL测定，根据ECL信号强度与循环肿瘤细胞浓度之间的线性关系，实现循环肿瘤细胞的定量检测。 10.根据权利要求9所述的电致化学发光免疫传感器用于测定循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞为MCF-7。
所属类别：	发明专利